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新一代纳米复合骨填充材料在60例胸腰椎结核手术中的应用
目的 探讨新一代纳米复合骨填充材料[由纳米羟基磷灰石(n-HA)与聚酰胺66(PA66)复合制成,n-HA/PA66]在胸腰椎结核手术中应用的临床疗效.方法 2011年1月至2013年6月在我院行前路手术采用n-HA/PA66复合骨填充材料进行植骨融合治疗的胸、腰椎结核患者60例.其中男36例,女24例;年龄19～75岁,平均年龄(42.4±10.6)岁.病变部位:胸椎29例,胸腰段16例,上腰椎15例;2个椎体47例,3个椎体11例,跳跃型2例.60例患者伴有后凸畸形49例,平均Cobb角(29.3±3.6)°;术前血红细胞沉降率为35～126 mm/1 h,平均为(59.8±13.9) mm/1 h.比较患者术前、术后的Cobb角、血红细胞沉降率及神经功能损害Frankel分级情况,通过对患者术后胸腰椎X线正侧位片及三维CT复查,评价植骨融合及n-HA/PA66复合骨填充材料下沉率等指标对疗效进行判定.结果 60例患者随访8～30个月(中位时间17.5个月),切口均一期愈合,未见内固定失败,术后即刻平均Cobb角为(13.1±4.5)°,末次随访时为(14.8±4.0)°,随访丢失为(1.7±0.5)°.31例术前诊断为不完全瘫痪的患者(Frankel分级B、C、D级),末次随访Frankel分级获得了0～2级的提高:其中4例术前B级的患者中1例改善为C级,3例改善为D级;8例C级的患者中3例改善为D级,5例改善为E级;19例D级的患者中18例改善为E级,1例无变化.至末次随访时,依据Brantigan植骨融合分级标准:E级34例、D级23例、C级2例、B级1例;植骨融合率95.0％(57/60例),植骨融合时间4～8个月,中位时间5.5个月.至末次随访发现该复合填充材料下沉距离平均(1.6±0.7)mm,其中2例患者下沉距离＞3 mm,下沉率为3.3％(2/60),无移位、破裂及内固定断裂患者;术后血红细胞沉降率恢复正常时间为3～7个月,中位时间4.5个月.结论 n-HA/PA66复合骨填充材料在胸腰椎结核手术中植骨支撑材料替代方面具有重要的应用价值,临床疗效满意.
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人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复山羊膝关节全层软骨缺损的实验研究
目的探索人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨，用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损的可行性。
方法从人脐带中分离、扩增培养人脐带间充质干细胞，并进行鉴定；以猪源脱细胞软骨细胞外基质取向支架为组织工程软骨支架载体；在成年山羊膝关节负重区股骨髁处造全层软骨模型；实验分为两组，以人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架修复组为实验组，单纯全层软骨缺损造模作为对照组，每组3只山羊。术后7 d、14 d 分别抽取关节液涂片行 H&E 染色，观察炎症反应。在术后3、6个月后分别处死两组实验动物，取材进行大体形态学观察及评分、组织学染色及评分、软骨特异性基质成分定量检测。
结果①关节液涂片 H&E 染色结果显示，术后两组膝关节炎症反应未见明显差异。②大体形态学观察及组织学染色结果均证实，实验组修复区再生的关节软骨更加接近天然软骨，且与周边整合良好，获得更好的修复效果。大体形态学及组织学评分均证实，实验组的评分均要明显高于对照组（P<0.05）；③糖胺多糖定量检测结果显示实验组明显高于对照组（P<0.05）。
结论人脐带间充质干细胞复合脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建组织工程软骨，可用于修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损，是未来治疗软骨损伤较有应用前景的方法之一。 -
网状纤维和α-平滑肌肌动蛋白/ED-1免疫组织化学双重染色方法
在同一张组织切片上探讨两种或两种以上的组织成分或抗原成分的相互关系时,可以采用双重染色方法.网状纤维是构成组织的网状支架,广泛分布于实质性脏器中,其中丰富的区域是肝、脾、淋巴组织、骨髓、基底膜和血管等处.网状纤维染色方法是一种组织化学方法,利用此方法可以显示和判定病变组织支架的破坏情况及纤维组织的增生情况[1].
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聚乙二醇交联去细胞瓣构建组织工程瓣膜复合支架
目的 采用分子量20 kDa 的枝化状丙烯酰化聚乙二醇(PEG)交联巯基化去细胞瓣,构建组织工程瓣膜复合支架,并对支架的结构稳定性、力学性能和细胞相容性进行初步检测.方法 取猪新鲜主动脉瓣叶,进行脱细胞瓣处理,制备去细胞瓣并巯基化.戊二醛固定去细胞瓣,PEG 交联巯基化去细胞瓣.形态学观察去细胞及交联效果,差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度,Ⅰ型胶原酶溶液测定其抗酶性分解能力,拉伸实验测定其抗拉强度和弹性模量,并采用AlamarBlue 法测定支架对MRC-5 人胚肺细胞的细胞毒性.结果 HE 染色和扫描电镜(SEM)显示去细胞完全,细胞外基质保存完整;PEG 交联后瓣叶变薄,纤维增粗呈束.PEG 交联瓣的热收缩温度为(75.16 ±0.69)℃,与去细胞瓣[(67.63 ±1.09)℃]相比有显著提高,其差异有统计学意义(P ＜0.05).PEG 交联瓣6 h 及12 h酶性分解率分别为(17.52 ±1.69)%和(48.83 ±2.67)%,与去细胞瓣[(64.91 ±2.05)%和(98.23 ±1.20)%]相比,分解率显著下降.PEG 交联瓣抗拉强度较去细胞瓣显著为高,并达到天然瓣水平,弹性模量则远高于其他各组.细胞毒性试验显示PEG 组和对照组活力细胞差别为(1.82 ±0.03)%,无统计学意义(P ＞0.05).结论 PEG 交联可显著改善去细胞瓣结构稳定性和力学性能,而无明显细胞毒性,有望用于组织工程瓣膜复合支架的构建.
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血管内皮细胞生长因子修饰的聚乙二醇化去细胞瓣构建心脏瓣膜复合支架
目的 对去细胞瓣进行聚乙二醇(PEG)化改性和血管内皮细胞生长因子(VEGF)共价修饰,以改善去细胞瓣力学性能和生物学性能,并联合内皮祖细胞构建心脏瓣膜复合支架.方法 枝化状PEG末端的丙烯酰基与引入到去细胞瓣上的巯基,通过迈克尔加成反应完成去细胞瓣的PEG化,并作去细胞瓣PEG化前后以及天然主动脉瓣的生物力学测定;通过PEG化去细胞瓣上未饱和的丙烯酰基与VEGF巾半胱氨酸残基上的巯基发生另一个迈克尔加成反应,对去细胞瓣进行VEGF共价修饰,免疫荧光测定VEGF修饰效果;在VEGF修饰的PEG化去细胞瓣、去细胞瓣和PEG化去细胞瓣上种植内皮祖细胞(EPCs),培养10 d后行瓣膜上DNA含量测定、苏木素.伊红染色和扫描电镜.结果 力学测试显示:PEG化去细胞瓣的大抗张强度较单纯去细胞主动脉瓣明显提高(P<0.05),而与天然主动脉瓣相比无差异(P>0.05);免疫荧光检测显示:VEGF可有效地共价修饰PEG化去细胞瓣;与PEG化去细胞瓣和单纯去细胞瓣相比,VEGF修饰的PEG化去细胞瓣明显促进EPCs的增殖,并且可在瓣膜表面形成一层连续的单细胞层.结论 PEG化可明显改善去细胞瓣的力学性能,并且VEGF修饰PEG化去细胞瓣可促进支架上黏附细胞的增殖,有利于改善组织工程心脏瓣膜的构建.
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模拟失重状态下雌性大鼠骨质疏松模型骨结构及性能变化研究
目的：研究模拟失重尾部悬吊雌性大鼠模型松质骨骨密度(bonemineraldensity，BMD)、骨小梁结构、骨组织形态、骨代谢生化指标及力学性能的改变，为女性航天员飞行后骨量变化及航天医学提供一定的理论支持。方法3个月龄雌性SD大鼠20只，随机数表法分为两组，尾部悬吊4周组和空白对照组，每组10只。连续饲养4周，定期记录大鼠活动、饮食、排便、体重、有无脱毛、有无死亡或尾部脱落等一般情况。到期处死大鼠，双能X线吸收法( dual-energy X-ray absorption，DEXA )测定L4椎体、股骨踝部骨密度，Micro-CT 进行骨小梁分析，改良丽春红染色法观察骨组织形态，ELISA法检测血清骨代谢生化标志物，并行生物力学检测。结果建模4周后，2组大鼠活动、饮食、排便均正常，体重增加量两组差异无统计学意义( P＞0.05)，2组均无脱毛、死亡或尾部脱落现象。悬吊组大鼠L4椎体、股骨髁部BMD均较对照组小，分别较对照组下降29%、30%( P＜0.05)。悬吊组L4椎体、股骨髁部的骨体积分数( bone volume/total volume， BV/TV )、表面积体积比( bone surface/bone volume，BS/BV )、骨小梁厚度( trabecular thickness，Tb.Th )、骨小梁数目( trabecular number，Tb.N )分别较对照组小，L4椎体各指标较对照组分别下降40%、15%、30%、33%( P＜0.05)，股骨髁部各指标较对照组分别下降21%、25%、50%、19%( P＜0.05)；骨小梁间隙( trabecular separation，Tb.Sp )悬吊组较对照组大，且L4椎体、股骨髁部较对照组分别增加92%、33%( P＜0.05)。腰椎松质骨ROI骨小梁三维重建发现，悬吊组大鼠腰椎椎体内骨小梁密集程度、骨小梁实质的体积、粗细程度及连续性均低于空白对照组，呈明显的“蜂窝样”改变，出现明显的骨质疏松和骨小梁三维结构破坏。50X 显微镜下也观察到悬吊组大鼠椎体骨质疏松样改变明显，骨小梁不连续、变细、间隙增大明显。悬吊组大鼠血清骨碱性磷酸酶( human bone alkaline phosphatase，BALP )、抗酒石酸酸性磷酸酶( tartrate resistant acid phosphatase，TRAP )含量均较空白对照组高，为空白对照组的4.5和3.1倍( P＜0.05)。悬吊组大鼠的腰椎大压缩载荷、大压缩应力、股骨的大抗弯曲载荷均较对照组小，且较对照组分别下降了36%、33%、34%(P＜0.05)。结论尾部悬吊雌性大鼠4周后出现严重的骨密度下降、骨小梁三维结构破坏、骨组织形态破坏、骨代谢失平衡、椎体及股骨生物力学显著下降，形成了明显的骨质疏松，理论上增加了骨折的风险。对女性航天员骨量丢失及骨折的风险应得到充分地认识。
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一种双相半月板支架修复兔内侧半月板缺失的实验研究
目的：研究脱钙骨基质／脱细胞半月板基质双相支架对兔内侧半月板缺失的修复作用的影响。方法取健康成年新西兰大白兔24只，建立兔膝关节左膝内侧半月板缺损模型，随机分为两组。 A组：空白对照组，兔左膝内侧半月板切除术后旷置；B组：双相支架植入组，兔左膝内侧半月板切除术后，脱钙骨基质／脱细胞半月板基质双相支架原位植入。分别于内侧半月板切除术后3、6个月处死兔并取材对比，行HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色以及天狼星红染色，并对各组半月板修复情况及其软骨保护情况进行形态学及组织学观察。结果本研究中的兔在手术后3、6个月处死后，观察其膝关节半月板及其对应股骨髁和胫骨平台软骨形态学和组织学，结果显示双相支架植入组要明显好于对照组，HE、甲苯胺蓝、番红O、天狼星红染色可见实验组新生半月板已经接近正常半月板。结论脱钙骨基质／脱细胞半月板基质双相支架对兔内侧半月板缺失后半月板的修复以及关节软骨的保护具有良好的作用，可以很好的促进半月板的再生，是一种良好的组织工程半月板的支架。
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组织工程骨研究背景与进展
随着骨缺损治疗方法的改进,组织工程骨的研究日益蓬勃,组织工程方法治疗骨缺损是一种新的模式.本文复习相关文献,综合报道组织工程骨的研究背景及其种子细胞、生物支架材料及组织工程骨构建三大要素的研究进展,探讨指出目前存在的问题和今后研究的方向.
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组织工程技术:适时从临床回归实验室
组织工程技术正逐渐从实验室向临床应用转化,作为该技术的临床试验中心之一,笔者遇到了一些限制该技术应用和推广的问题.本文将目前面临的临床问题及相应有望的解决措施,依据组织工程三要素(种子细胞、支架材料及培养环境)的分类原则进行了总结.为解决这些问题,研究者们还是需要回归实验室,从初的体外培养阶段开始寻找思路.
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生物活性黏合涂层改善组织工程视网膜神经支架生物黏性的研究
目的 探讨生物活性黏合剂对组织工程视网膜神经支架材料的生物黏性修饰效果.方法 实验研究.将层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖重组蛋白等组合构建生物活性黏合剂,评估不同配比浓度的黏合剂对支架材料的黏合效果;细胞计数及CCK-8实验分析黏性修饰支架对细胞生长及毒性影响;通过23 G玻璃体切除术联合黏合修饰的支架黏附于6只新西兰兔一侧眼的视网膜,对侧眼植入未黏合修饰的支架.术后使用眼压测量、眼底照相及OCT观察支架网膜黏附及组织相容性情况.不同配比浓度生物黏合剂修饰神经支架的黏附效果比较采用卡方检验;不同支架材料的细胞黏附率比较采用Mann-Whitney U检验;不同支架材料的细胞成活率比较采用单因素F分析;移植术后不同组间兔眼眼压采用重复测量F分析.结果 层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖比例为60％:30％:10％:10％的生物黏合剂在浓度体积比为30μl/mm2时其24 h黏合率为91.7％,对神经支架的黏附效果较好(x2=8.79,P＜0.05);培养24 h后,黏性修饰支架的细胞黏附率(86.85％)显著高于未修饰支架(13.78％,U=0.01,P＜ 0.05),而两者的细胞成活率差异无统计学意义(F=7.235,P=0.11);内眼移植术后黏性修饰支架兔眼眼压(18.4±0.93) mmHg与非黏性修饰支架(17.1±1.04) mmHg差异无统计学意义(F=79.16,P=0.07);黏性修饰支架移植术后7d的视网膜黏附率为80％,眼底检查示术眼网膜及玻璃体腔未见炎性反应.结论 生物活性黏合剂对组织工程视网膜神经支架材料具有良好的生物黏性修饰作用,可为组织工程材料视网膜移植应用奠定实验基础.
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人牙周膜干细胞与聚己内酯支架的三维生物打印初探
目的 探讨用人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)和聚己内酯支架进行三维生物打印的技术方案,并分析三维打印体的生物学性能,探索颅颌面骨缺损修复新途径.方法 以PDLSC为种子细胞、聚己内酯为支架材料,设计打印体尺寸为13.0 rnm×13.0 mm,网格尺寸分别为0.25 mm×0.25 mm(A组)和0.75 mm×0.75 mm(B组),进行三维生物打印;扫描电镜观察三维打印体上细胞状态;细胞计数试剂盒检测培养1、3、5d细胞增殖情况;成骨诱导14d后,茜素红染色法观察三维打印体的矿化结节.结果 以PDLSC为种子细胞、聚己内酯为支架,可打印两种网格尺寸的三维打印体,A、B组三维打印体厚度和宏观孔隙率分别为1.1、1.5 mm和49.3％、72.5％.扫描电镜可观察到两组三维打印体上PDLSC增殖,且在A组三维打印体上增殖更明显.成骨诱导后可见大量红色矿化结节形成于两种三维打印体上.结论 利用三维生物打印设备可成功打印具有自定义形状、尺寸的三维打印体,PDLSC可在其上生长、增殖,且在宏观孔隙率低的三维打印体上细胞生长更好.
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覆盖富血小板血浆3D打印聚己内酯支架对牙髓细胞体外生物学行为的影响
目的 探讨覆盖不同处理方法 富血小板血浆(PRP)的3D打印聚己内酯(PCL)支架对牙髓细胞黏附、增殖及分化的影响.方法 用冻干法和凝胶法制备PRP并覆盖在3D打印的聚己内酯支架上,免疫荧光染色观察各组支架牙髓细胞的早期黏附情况,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞迁移情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定ALP活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞成骨相关基因的表达.采用单因素方差分析进行统计分析,LSD-t检验进行两两比较.结果 免疫荧光结果 显示黏附在冻干组的细胞多(1999.33个/总视野),凝胶组次之(1043.33个/总视野),单纯支架组少(843.00个/总视野),而且冻干组和凝胶组相比,差异有统计学意义(F=19.36,P<0.01),冻干组和单纯支架组对比,差异有统计学意义(F=23.42,P<0.01).细胞增殖实验显示,3组支架的细胞都呈增长趋势,但是在各个测定时间点,任何2组之间的细胞增殖都没有显著差异.细胞迁移结果 显示,冻干组(279.75个/视野)和凝胶组(167.00个/视野)的细胞数目显著高于单纯支架组(134.75个/视野),差异有统计意义(F冻单组=7.45、F凝单组=1.88,P<0.01),而冻干组和凝胶组相比则差异无统计学意义.ALP活性结果 显示,3个组别中冻干组活性高(ALP7 d=12.57 U/gprot、ALP14 d=23.20 U/gprot、ALP21 d=58.98 U/gprot),在第7天凝胶组次之(6.65 U/gprot),单纯支架组低(5.93 U/gprot),而在第14和21天,单纯支架组次之(ALP14 d=15.56 U/gprot、ALP21 d=53.74 U/gprot),凝胶组低(ALP14 d=13.35 U/gprot、ALP21 d=47.83 U/gprot).在第7、14和21天,冻干组的ALP活性显著高于凝胶组(F7 d=3.20,P7 d<0.01;F14 d=5.34,P14 d<0.01;F21 d=6.04,P21 d<0.01)和单纯支架组(F7 d=3.60,P7 d=0.04;F14 d=4.14,P14 d<0.01;F21 d=2.84,P21 d=0.01).在第7和14天,凝胶组和单纯支架的细胞ALP活性相比差异没有统计学意义.成骨相关基因表达中,在第7和14天的RUNX2和OCN表达中,除了第14天的凝胶组的OCN表达外,冻干组(OCN7 d=4.67、RUNX27 d=2.32、RUNX214 d=5.88)的表达高于单纯支架组(OCN7 d=1.00、RUNX27 d=1.00、RUNX214 d=1.00),差异具有统计意义(F7 d=11.1,P7 d<0.01;F7 d=3.20,P7 d=0.04;F14 d=11.80,P14 d<0.01),凝胶组(OCN7 d=2.60、RUNX27 d=2.23、RUNX214 d=4.67)的表达显著高于单纯支架组,差异有统计学意义(F7 d=4.85,P7 d<0.01;F7 d=2.98,P7 d=0.03;F14 d=8.87,P14 d<0.01).在第7天的OCN和第14天的RUNX2的表达中,冻干组(OCN7 d=4.67)的表达水平高于凝胶组(OCN7 d=2.60),差异有统计学意义(F=6.26,P<0.01);而在第14天的OCN中,凝胶组表达和冻干组无明显差异.结论 覆盖PRP的3D打印PCL支架比单纯的支架更有利于牙髓细胞的黏附、增殖和成骨分化,且冻干法优于凝胶法.
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牙髓血运重建术治疗年轻恒牙根尖周病的研究进展
根管内血运重建术是Iwaya在2001年首次提出的一种牙髓再生方法，主要通过彻底有效的根管消毒，为牙髓干细胞、牙乳头间充质干细胞等增殖和分化提供良好的环境，从而促使牙根继续发育，多用于治疗年轻恒牙根尖周炎。至今，已有多位学者报道采用该方法取得了令人满意的结果，即患牙的根尖周损害影像消失、牙根继续发育。本文将从根管内血运重建术的发生原理、组织学来源、抗菌剂的应用及组织支架等方面的研究进展做一述评。
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人牙髓细胞在3种生物活性支架上的生长能力
目的:观察人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)在生物活性支架上的增殖及分化情况.方法:采用酶消化法培养hDPCs,传至第4代用于实验.用免疫组织化学法鉴定细胞并测定细胞基质前体细胞抗原-1(stromal precursor antigen-1,STRO-1)表达率.实验使用3种支架,包括胶原(collagen,COL)支架、胶原-生物活性玻璃(collagen-bioglass,COL-BG)支架及胶原-生物活性玻璃-聚己内酯(collagen-bioglass-polycaprolacton,COL-BG-PCL)支架.将hDPCs植入支架,采用MTT法于6h、1d、3d、5d、7d、14 d和21 d测定hDPCs增殖,在14 d进行碱性磷酸酶染色.结果:实验所用hDPCs中含有STRO-1阳性细胞；hDPCs在COL-BG支架及COL-BG-PCL支架上的增殖显著高于COL支架(P＜0.05),尤其在14d和21 d COL-BG支架及COL-BG-PCL支架的光密度值是COL支架的5倍；COL-BG支架及COL-BG-PCL支架上的碱性磷酸酶染色区明显较COL支架广泛.结论:hDPCs在COL-BG支架及COL-BG-PCL支架上增殖和分化活跃,优于传统的COL支架.
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两种矿化胶原的显微结构对成骨样细胞MG63形貌的影响
目的:研究两种矿化胶原的显微结构对人成骨样细胞MG 63的黏附力和形貌的影响.方法:采用传统矿化法和生物仿生矿化法分别制备纤维外矿化胶原(extrafibrillarly-mineralized collagen,EMC)与纤维内矿化胶原(intrafibrillarly-mineralized collagen,IMC)支架材料,人成骨样细胞MG 63作为实验用细胞,用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)检测两种支架材料的显微结构及细胞与材料间相互作用.采用激光共聚焦显微镜(laser scanning microscope,LSM)检测接种在材料上细胞的黏附力与形貌.结果:不同矿化方式影响胶原的显微结构.EMC组可见花样团簇状的晶体无规则沉积在纳米纤维束表面,而IMC组纤维束表面光滑,无晶体沉积.能谱分析结果显示其内部含有晶体,为含碳的钙缺乏型羟基磷灰石,这与天然骨矿化胶原成分类似.LSM结果显示,IMC比EMC支架材料更能促进MG 63细胞伸展.荧光定量分析结果表明MG 63细胞对IMC支架材料的黏附力(18.54 ± 2.71)明显高于EMC支架材料(14.29 ± 1.32).SEM结果显示两种矿化胶原均具有良好的生物相容性,细胞在不同支架上呈现不同的形貌.结论:矿化胶原的显微结构影响细胞的形貌,IMC支架材料更能促进MG 63细胞的黏附与伸展,这将有助于研制新的牙槽骨再生的生物仿生材料.
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骨组织3D 打印：骨再生的未来
创伤、肿瘤切除、手术翻修、畸形矫正及感染等原因均可造成骨质缺损并进而引起骨延迟愈合或不愈合，迄今骨缺损及骨不愈合仍然是骨科临床需要解决的重要问题。目前，治疗骨缺损的方法主要包括自体骨移植、异体骨移植以及人造材料填补。众所周知，自体骨移植是治疗骨缺损主要也是可靠的方法，但自体骨取自患者的髂骨等部位，取骨量有限且伴随新的创伤，在骨缺损较大时难以满足临床需求；异体骨经过处理可使其免疫原性降低，但同时也会造成骨传导、骨诱导能力的降低，另外，其传播感染性疾病的风险也不容忽视，据报道美国异体骨移植患者的人类免疫缺陷病毒（ human immunodeficiency virus， HIV）感染率为1／160万［1］。近些年来人造材料，如羟基磷灰石、硫酸钙等已用于骨缺损的填充，然而实际效果逊于自体或异体骨，为此，人们正在探索新的途径和技术来破解骨缺损治疗的临床难题。3D打印技术的兴起或许可以为解决上述难题带来希望。
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大鼠肝细胞在肝脏脱细胞支架内的体外三维循环灌注培养
目的：制备大鼠肝脏脱细胞支架，将肝细胞再植于脱细胞支架并进行体外循环灌注培养，为肝脏脱细胞支架应用于肝脏组织工程学提供实验基础依据。方法采用灌注法制备大鼠肝脏脱细胞支架，HE、苦味酸-天狼星染色、免疫组织化学检测脱细胞支架结构及成分，扫描电镜显示脱细胞支架超微结构，DNA含量检测脱细胞效果；构建循环灌注培养体系；采用经门静脉途径和包膜直接注射这两种方法将肝细胞种植于脱细胞支架内，行体外循环灌注培养，检测支架内肝细胞的代谢功能，培养完成后行HE、ALB免疫荧光、扫描电镜，观察细胞在支架内生长情况。结果采用灌注法获得大鼠肝脏脱细胞支架，组织学染色未见细胞核成分，同时可见细胞外基质成分保留；免疫荧光显示Ⅰ型胶原蛋白保留；扫描电镜显示细胞外基质呈网状超微结构；DNA含量为（47.5±18.1） ng／mg；构建出由蠕动泵、氧合器、培养瓶、输送管道组成的循环灌注培养体系，包膜直接注射法种植成功率优于经门静脉途径，大鼠肝细胞在支架内合成、代谢功能良好，HE、免疫荧光、扫描电镜显示肝细胞在脱细胞支架的细胞外基质三维环境中定植，生长状态良好。结论采用循环灌注法获得的大鼠肝脏脱细胞支架具有良好的理化性质，循环灌注培养体系结合肝脏脱细胞支架可以为肝细胞提供良好的三维生长环境。
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动态机械刺激对体外构建组织工程纤维环的影响
目的 探讨动态机械刺激对体外构建环形取向性丝素蛋白组织工程纤维环的影响.方法 采用环形取向性丝素纤维环支架复合兔纤维环(annulus fibrosus,AF)细胞体外培养3、7、14d,对其进行不同幅度(5％形变量、10％形变量、15％形变量、20％形变量)的动态压缩刺激.固定后采用体视显微镜、扫描电镜观察支架和细胞-支架复合物的大体及微观形态.组织学染色观察细胞在支架上的增殖和分泌情况,并行总DNA定量分析及黏多糖(glycosaminoglycan,GAG)、胶原生化定量分析,检测其机械性能的变化.结果 细胞支架复合物颜色随时间延长而加深.细胞黏附在支架上,且分泌大量细胞外基质,细胞及胞外基质随时间增多.组织学染色、总DNA定量、蛋白多糖、Ⅰ型胶原生化定量检测显示细胞增殖明显,细胞外基质分泌逐渐增加.压缩模量随培养时间增加而逐渐增加.施加力学刺激后,大体观察见不同形变量组支架细胞复合物颜色均随时间加深.HE染色可见不同形变量组细胞及其分泌物均随时间而增加,番红“0”染色、Ⅰ型胶原染色均可见蛋白多糖和胶原分泌随时间延长而增多.其中GAG定量在15％形变量组大,Ⅰ型胶原定量在10％形变量组大,总DNA定量在5％形变量组大,压缩弹性模量在15％形变量组大.力学加载前后组织工程椎间盘高度变化无统计学差异.结论 适宜的动态机械刺激能够促进体外构建的环形取向性丝素蛋白组织工程纤维环在生化组成和机械性能方面向天然纤维环靠近,过度的压缩会加速细胞凋亡.
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BMG/PBST双相组织工程纤维环的体外构建
目的：探讨骨基质明胶（bone matrix gelatin, BMG）/聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succi?nate?co?terephthalate), PBST]双相组织工程纤维环的构建。方法 PBST通过静电纺丝的方式制备成薄膜，检测其吸水率、孔隙率。取兔纤维环细胞进行体外培养，并通过番红“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行细胞鉴定；鉴定后的细胞种植到PBST薄膜支架上，通过扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况。以BMG作为外纤维环支架，以PBST纺丝作为内纤维环支架，构建新型双相组织工程纤维环支架。将细胞种植到双相支架上，体外培养3、7、21 d后，分析双相组织工程纤维环的生物学特性及力学性能。结果 PBST纺丝薄膜的孔隙率为61.83%±7.33%，吸水率为297.34%±57.13%。纤维环细胞经番红“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定呈阳性，表现出纤维环细胞的特征。经鉴定后的细胞种植在薄膜支架上培养3、7d后，扫描电镜显示细胞在薄膜支架上黏附并增殖；将纤维环细胞接种到BMG/PBST双相支架上，培养3、7、21 d后，HE染色显示细胞随培养时间的增加逐渐渗透到薄膜支架内部；番红“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，表明细胞在支架上分泌出大量糖胺聚糖和Ⅱ型胶原等纤维环细胞特有的细胞外基质。种植细胞后的双相支架体外培养21 d后，支架的弹性模量[（17.56±1.47）MPa]明显较无细胞的双相支架的弹性模量[（14.83±1.02）MPa]增加。结论初步构建的BMG/PBST双相组织工程纤维环具有良好的细胞相容性和力学性能，为进一步构建完整组织工程椎间盘奠定了基础。
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兔胫骨骨膜去细胞生物支架制备方案的优化
目的 探讨制备兔胫骨骨膜去细胞生物支架的佳方案.方法 取健康新西兰大白兔70只,游离双侧胫骨近端内侧骨膜,共获取骨膜标本140个.用以下三种方案处理骨膜:方案1,物理冻融(-80℃,24 h),置入含体积分数2％Triton-X100和3.5×10-5 mol/L PMSF的脱细胞混合液中振荡18h,10 g/L SDS溶液中振荡12h,酶消化(DNA酶、RNA酶);方案2,SDS仅振荡6h,其他同方案1;方案3,改10 g/L SDS溶液中振荡12h为0.5 mol/L NaCl溶液中振荡12h,其他同方案1.三种方案制备的支架及未处理的新鲜骨膜通过HE、DAPI和基因组DNA定量分析测定细胞结构及DNA含量是否小于评价去细胞的标准浓度50 ng/mg;以番红“O”染色、Masson染色和羟脯氨酸测定法定性、定量检测骨膜细胞外基质主要成分(胶原、糖胺聚糖)的保留情况;以扫描电镜观察骨膜去细胞生物支架的表面微结构;以异体皮下包埋实验观察支架的炎细胞浸润等免疫排斥反应及组织重构现象.结果 经方案1、2和3处理后,HE染色切片光镜下去细胞支架均无残留细胞,DAPI荧光染色未发现细胞核及核碎片存在,DNA定量检测组织去细胞率均达95％以上且含量均小于50 ng/mg.方案3与方案1和2相比,骨膜去细胞支架中主要成分[胶原定量(36.94±0.70) μg/mg]保留更加完整,电镜下观察支架的胶原连续无断裂,胶原纤维排列规整,完整性好;异体皮下包埋后炎细胞浸润较少,免疫排斥反应不明显,并出现支架降解及重构现象.结论 应用物理冻融(-80℃,24 h)、含体积分数2％Triton-X 100和3.5×10-5 mol/L PMSF的脱细胞混合液中振荡18h、0.5 mol/L NaC1溶液中振荡12h及酶消化(DNA酶、RNA酶)处理后的骨膜生物支架去细胞更彻底,细胞外基质结构和成分保留更完整,且植入体内后免疫排斥反应小,生物相容性好.
