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龋病发展为牙髓炎过程中牙髓干细胞生物学特性研究
龋病是以细菌为主的多因素作用下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病,随着龋病的进展速度加快,成牙本质修复能力不足导致牙本质破坏加重形成深龋,直至引起牙髓炎.本研究将从细胞形态上,利用茜素红染色和碱性磷酸染色方法来验证炎症状态下牙髓干细胞成牙本质分化能力降低.阐明炎症刺激下牙髓干细胞成牙本质分化的机制及寻找牙髓炎新的治疗靶点提供理论及实验依据.
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牙髓干细胞在再生医学中的应用进展
干细胞实为一类具有一定分化潜能与自我修复能力的细胞,在特定环境或条件下,其能够分化成各种拥有不同功能的细胞.依据干细胞的发育阶段及其所具有的功能学特性,可将其划分为两类,即成体干细胞与胚胎干细胞.所以,在再生医学中及组织工程中,肝细胞发挥着重要作用与价值.本文以牙髓干细胞为对象,就其在再生医学中的应用进展作一综述.
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N-乙酰氨基葡萄糖转移酶调节O-GlcNAc修饰在牙髓干细胞成骨分化中的作用
糖尿病能抑制成骨细胞分化,是牙周炎引起牙槽骨吸收的常见因素.本研究发现高糖状态下N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetyl glucosamine transferase,OGT)表达增加,对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)进行O-GlcNAc修饰.所以我们提出在糖尿病发病过程中,OGT可通过催化DPSCs的O-GlcNAc修饰,影响成骨分化的靶基因Runx2表达,调节了DPSCs成骨发生的假说.为糖尿病引起牙槽骨缺失的靶向治疗提供了重要的临床意义.
关键词： N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 牙髓干细胞 糖尿病 成骨分化 -
龋病牙髓干细胞成牙本质分化研究
龋病发病率位于口腔疾病的首位,是人类三大重点防治疾病之一.龋病的病理过程伴随着炎症刺激.而炎症与牙髓干细胞分化关系密切.本研究将龋病的牙髓干细胞与正常状态下的牙髓干细胞成牙本质分化能力做比较.结果显示龋病环境下DPSCs成牙本质分化相关标记物表达增高,成牙本质分化能力增强.本课题的研究为阐明龋病环境下牙髓干细胞成牙本质分化能力的改变提供理论基础.也为临床治疗龋病提供了新的理论依据.
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牙髓干细胞培养及分化的研究进展
干细胞是未分化的细胞，具有自我更新、高度增殖及多向分化等特性。牙髓干细胞（ dental pulp stem cell，DPSC）不仅具有干细胞的上述特性，而且具有取材方便、易于培养、易于冷藏等优点。本文就 DPSC 与其他三种干细胞在培养多向分化潜能、分化诱导因素、向诱导性多功能干细胞（ induced pluripotent stem cell，iPSC）的分化潜能以及在组织工程学中的应用进行比较，并讨论 DPSC 的培养及分化优势。
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人牙髓干细胞与脱细胞猪小肠黏膜下层的生物相容性
目的 探讨体外培养的人牙髓干细胞(DPSCs)与脱细胞猪小肠黏膜下层(SIS)的生物相容性,为组织工程角膜上皮构建寻找理想的种子细胞.方法 改良酶组织块法,培养人DPSCs并鉴定.细胞计数试剂盒(CCK-8)实验分别检测脱细胞SIS浸提液及脱细胞SIS对DPSCs增殖活性的影响.实验分组:(1)脱细胞SIS浸提液培养组为实验组,含10％胎牛血清的DMEM培养基培养组为对照组;(2)复合脱细胞SIS培养组作为实验组,非复合脱细胞SIS培养组为对照组.HE染色检测DPSCs接种于脱细胞SIS后的生长情况.结果 成功获取DPSCs.脱细胞SIS浸提液及脱细胞SIS对DPSCs增殖无明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).DPSCs接种第3天和第7天后,能够在脱细胞SIS表面生长,支架纤维有断裂,细胞间有一定的连接.结论 DPSCs与脱细胞SIS具有一定的生物相容性,有望用于组织工程角膜上皮的构建.
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Hes1调控牙髓干细胞增殖及对成牙本质分化相关蛋白表达的影响
目的 探讨发状分裂相关增强子1(Hes1)对牙髓干细胞增殖及对成牙本质分化相关蛋白的表达影响.方法 分离人牙髓干细胞,细胞转染小干扰RNA对照(siRNA control)和Hes1小干扰RNA(siRNA Hes1)分别记为阴性组和干扰组,同时以没有转染的细胞为对照组.RT-PCR和Western blot检测转染效果,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)蛋白表达.结果 与对照组相比,阴性组 Hes1 mRNA和蛋白水平无显著差异;干扰组 Hes1 mRNA和蛋白水平明显降低;与对照组相比,阴性组细胞存活率无显著差异(P=0.999),干扰组细胞存活率明显降低(P=0.026).与对照组相比,阴性组ALP活性无显著差异(P=0.800),干扰组ALP活性明显升高(P=0.004).与对照组相比,阴性组DSPP、OCN水平无显著差异(tDSPP=0.408,PDSPP=0.704,tOCN=0.271,POCN=0.800),干扰组DSPP、OCN水平明显升高(tDSPP=5.543,PDSPP=0.005,tOCN=10.063,POCN=0.001).结论 干扰Hes1表达能够抑制牙髓干细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,促进分化相关蛋白表达.
关键词： 牙髓干细胞 分化 增殖 发状分裂相关增强子1 -
牙髓干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究
目的:探讨牙髓干细胞移植治疗脊髓损伤的神经修复及运动功能恢复情况.方法:培养取材第2代来源于第三磨牙的人牙髓于细胞,鉴定其表面标记物,应用B27、碱性呈纤维细胞生长因子和胰岛素转铁蛋白硒进行神经诱导,并行免疫荧光染色检测.改良Allen's法制作SD大鼠脊髓损伤模型,3d后随机分为实验组及对照组,每组各20只大鼠.分别于脊髓损伤处注入人牙髓干细胞及生理盐水,于造模后1d、治疗前1d、治疗后3d、治疗后7、14、28d进行动物后肢运动功能检测.28d时脊髓取材进行HE染色,观察脊髓空洞形成,计算空洞面积;Tunnel法检测两组细胞凋亡情况;免疫荧光双标法标记HuNu-NeuN和HuNu-GFAP,观察人牙髓干细胞体内生长分化情况.结果:细胞培养传代后呈长梭形,细胞形态均匀,胞浆丰富、胞核增大,细胞平行排列呈漩涡状或螺旋状.流式细胞仪分析人牙髓干细胞诱导分化后高表达CD44、CD90和CD146,低表达STRO-1,CD34、CD45表达阴性.人牙髓干细胞神经诱导14d,免疫荧光标记GFAP、NeuN呈阳性.细胞移植3d、7d,两组间BBB评分无统计学差异;细胞移植14d及28d实验组BBB评分分别为3.8±0.8、7.2±1.6,对照组BBB评分为2.2±0.8、3.6±1.1,两组间比较差异有显著性(P＜0.05).28d时HE染色两组均可见脊髓出血、炎性细胞浸润、小血管增生及空洞形成.实验组脊髓空洞面积百分比(26.75±2.50)％,对照组为(49.50±6.25)％,两组差异有统计学意义(P＜0.05);Tunnel法检测实验组神经细胞凋亡百分比(32.33±1.54)％,对照组为(46.33±1.53)％,实验组显著减少神经细胞的凋亡(P＜0.05).免疫荧光双标法检测到部分细胞为带有HuNu-NeuN和HuNu-GFAP双抗体细胞.结论:人牙髓干细胞能够在体外特定条件下及移植入脊髓损伤大鼠体内可分化为神经细胞,用于治疗脊髓损伤时可减少神经细胞的凋亡,促进后肢运动功能的恢复.
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人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究
目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨向分化,RT-PCR检测成骨细胞的特异相关或标志基因.结果:人恒牙牙髓干细胞经成骨向培养基诱导后表现出成骨细胞特性,碱性磷酸酶和Von Kossa染色结果均为阳性,RT-PCR检测成骨向分化相关基因I型胶原、骨涎蛋白、骨钙素、Runx2和Osterix均有阳性表达.结论:恒牙牙髓干细胞具有向成骨细胞分化的潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.
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应用人恒牙牙髓干细胞与明胶支架构建组织工程骨的研究
目的 构建由人恒牙牙髓干细胞和三维明胶支架组成的组织工程骨,并验证其成骨效果.方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙牙髓组织中应用酶消化法获得牙髓细胞,单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞.第3代细胞被分别接种到6孔板或三维明胶支架上进行成骨向诱导培养,诱导14天后支架组移植入裸鼠背部皮下.应用ALP染色、Von Kossa染色验证牙髓干细胞的体外成骨能力;应用X线、HE染色和免疫组化验证组织工程骨的体内成骨效果.结果 牙髓干细胞体外成骨向诱导后7、14天ALP染色呈阳性;14、21天Von Kossa染色形成矿化结节.在体内组织工程骨成骨明显,X线显示实验侧支架内有团块状高密度阻射影;HE染色显示大量的骨组织形成;免疫组化显示骨结构区域骨桥蛋白、骨涎蛋白和骨钙素阳性表达.结论 人恒牙牙髓干细胞和明胶支架构建形成了组织工程骨.
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人恒牙牙髓干细胞分化为脂肪细胞的体外实验研究
目的 验证人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外向脂肪细胞的定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定.方法 从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成脂肪向诱导培养基向脂肪细胞诱导分化.用油红O染色鉴定成脂肪向分化,RT-PCR检测脂肪细胞的特异相关或标志基因.以同期培养的未诱导的普通培养基培养的DPSCs做阴性对照;以同期培养的骨髓间充质干细胞成脂肪向分化的结果做阳性对照.结果 人恒牙牙髓干细胞经成脂肪向培养基诱导后表现出脂肪细胞特性,油红O染色结果为阳性,RT-PCR检测成脂肪向分化相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2、脂肪酶结合蛋白aP2和脂蛋白脂酶均有阳性表达.结论 人恒牙牙髓干细胞在体外具有分化为脂肪细胞的潜能.
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黄芪注射液对人牙髓干细胞神经分化的影响
目的 探讨黄芪注射液对人牙髓干细胞神经分化功能的影响.方法 采用不同浓度的黄芪注射液和神经诱导培养基诱导人牙髓干细胞分化为神经元样细胞.从细胞形态、Real-Time PCR和Western blot蛋白印记检测神经元标记蛋白巢蛋白、早期神经元标记蛋白微管蛋白和神经元特异性烯醇化酶等的表达.结果 加入黄芪注射液诱导后人牙髓干细胞胞体收缩,伸出细长凸起,形似神经元;Real-Time PCR和Western blot结果显示黄芪注射液可促进巢蛋白、微管蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.诱导效果与药物浓度有关.黄芪注射液浓度200和100μl/mL效果佳.结论 200和100μl/mL黄芪注射液可促进人牙髓干细胞神经分化能力.
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尼莫地平对大鼠牙髓干细胞分化后DMP-1表达的影响
目的 观察尼莫地平对牙本质基质蛋白-1在大鼠牙髓干细胞分化前后基因表达的影响.方法 通过特殊培养液诱导大鼠牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化,实验组分为正常诱导组和加入尼莫地平干扰组,在诱导后的不同时间点,1、3、5、7、10和14天,分别提取细胞的总RNA,通过Real-time PCR观察大鼠牙髓干细胞分化前后牙本质基质蛋白-1基因表达的变化,数据采用独立样本t检验.结果 大鼠牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化后,1、3天的牙本质基质蛋白-1表达没有明显变化(P＞0.05);5天变化较明显,差异有统计学意义(P＜0.05);5、7、10和14天随着时间增加牙本质基质蛋白-1基因表达明显增高.加入尼莫地平干扰的诱导分化组和正常诱导组比较,同一时间点,牙本质基质蛋白-1的表达量减少(P＜0.05).结论 尼莫地平可减少牙本质基质蛋白-1在大鼠牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化后的表达,推测L型钙离子通道可能在牙髓干细胞的分化中起重要的作用.
关键词： 牙髓干细胞 L型钙离子通道 成牙本质细胞方向分化 牙本质基质蛋白-1 -
1,25(OH)2维生素D3矿化液对人牙髓干细胞成骨方向诱导作用的研究
目的 研究维生素D<,3>矿化液对人牙髓干细胞的成骨方向诱导是否有促进作用.方法 从恒牙牙髓中分离培养成纤维样细胞并测试其间充质干细胞的特异性标记物Stro-1阳性率,用一定浓度的1,25(OH)<,2>维生素D<,3>抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的矿化液诱导牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色及骨钙素、I型胶原基因表达观察和检测矿化液诱导后细胞形态变化及矿化基质分泌情况,以未诱导组为对照.结果 维生素D<,3>矿化液连续诱导21d后,诱导组的细胞碱性磷酸酶染色阳性、I型胶原和骨钙素的基因表达阳性,并可见明显钙结节形成.结论 维生素D<,3>矿化液可以诱导人牙髓干细胞向成骨样细胞分化并促进其产生矿化基质.
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牙髓干细胞诱导iPS细胞的无饲养细胞培养条件研究
目的 研究适合牙髓干细胞诱导iPS细胞的无饲养细胞培养条件与方法.方法 分离牙髓干细胞,慢病毒介导Lin28、Nanog、Oct4和Sox2因子重编程获得iPS细胞.在不同浓度及不同处理时间的基质胶(Matrigel)上传代培养iPS,检验iPS的单细胞生长密度,比较不同基质胶培养方法对iPS生长的影响.结果 DPSC iPS在60ug/cm2浓度的基质胶上生长密度高;基质胶覆盖2小时后应用可以获得好的DPSC iPS生长密度.结论 应用60ug/cm2浓度的基质胶覆盖培养板2小时是DPSC iPS无饲养细胞培养的佳条件.
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内皮细胞及内皮素1在牙发生和骨形成中的作用研究
内皮细胞(Endothelial cell,ECs)位于血液与血管组织之间,它不仅能完成血液和组织液的代谢交换,并且能合成和分泌多种生物活性物质,如内皮素1 (Endothelin-1,ET-1)和胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,sIGFs)等.ET-1早在主动脉血管内皮中提取,是一种由21个氨基酸残基组成的活性多肽,也是是一种内源性长效血管收缩调节因子,可影响骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的增殖和分化.牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)与骨髓间充质干细胞有相似的细胞形态、免疫表型及形成矿化结节的能力,在体外诱导条件下可分化为牙体组织及骨组织.了解ECs及ET-1对DPSCs和BMSCs的作用机制对牙发生和骨形成具有重要作用.
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牙髓干细胞在组织工程中的研究进展
理想的种子细胞一直是组织工程的研究热点.自体来源的牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有良好的增殖能力和多向分化潜能,无胚胎干细胞的致瘤性及异体干细胞的免疫排斥反应,且其取材过程避免了对人体的二次创伤和伦理法律问题,近年来日益受到关注.本文分析整理了关于牙髓干细胞的来源、表面标志物的鉴定以及在组织工程中的应用现状,并对其未来的研究方向进行展望.
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人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究
目的 体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化.方法 选择因正畸目的 而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定.单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选.矿化液定向诱导分选后的牙髓十细胞,比较诱导前后Stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)的改变.结果 体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性.牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞附性率约为10%.矿化诱导后细胞Stro-1阴性、ALP阳性表达.结论 采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础.
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转化生长因子β3联合牙髓干细胞在种植体周围早期骨结合中的作用
目的 建立兔下颌骨前牙区种植修复动物实验模型,探讨转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β3联合体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)在兔种植体周围骨结合中的作用.方法 将实验新西兰兔按随机数字表随机分为实验组、对照组和空白组,每组6只,在实验组的种植体与骨间隙内充填TGF-β3、DPSC、人工骨粉的混合物,在对照组的种植体与骨间隙内充填DPSC、人工骨粉的混合物,在空白组的种植体与骨间隙内充填磷酸盐缓冲液和人工骨粉的混合物.术后2周处死各组动物,观察游离下颌骨并对种植体周围骨组织进行HE染色和免疫组化染色,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达水平.结果 种植体植入后均无脱落、松动.HE染色结果显示空白组可见种植体周围骨小梁稀疏,未见明显新骨形成,少量血管;对照组可见种植体周围骨小梁较稀疏、纤细,成骨细胞呈线状排列在骨小梁周围,少量新骨形成;实验组可见种植体周围骨小梁较多,其粗大且致密,成骨细胞呈密集成团排列、功能活跃被基质包裹,新骨形成较多,可观察到典型的骨陷窝、骨细胞并伴有大量新生血管.免疫组织化学结果显示实验组、对照组、空白组骨涎蛋白的平均阳性面积所占比例分别为(24.6±5.3)％、(11.3±2.8)％及(7.6±3.8)％.实验组骨涎蛋白呈强阳性表达,明显高于其他两组(P=0.000,P=0.000 ).实时荧光定量PCR结果显示实验组RUNX相关转录因子2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶基因的表达水平均高于空白组和对照组,且差异均有统计学意义(P=0.023).结论 TGF-β3具有促进DPSC向成骨细胞转化的潜能,能增加成骨细胞的数量并促进种植体周围骨结合,为解决临床种植骨愈合时间过长等问题提供新思路.
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载血管内皮细胞生长因子微球促进牙髓再生和血管形成的实验研究
目的 评价载血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)微球促进牙髓再生和血管形成的作用,以期为应用组织工程技术探索牙髓治疗新方法奠定基础.方法 应用前期制备的载VEGF微球进行体外释放实验和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)迁移实验明确微球释放VEGF的特点;将牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)与载VEGF微球共培养,观察细胞与微球的相容性;DPSC与载VEGF微球经根尖孔注入根管腔,植入裸鼠背部皮下,9周后进行组织学和免疫组织化学观察.以DPSC、载VEGF微球单独注入根管,空白根管作为空白对照组.结果 DPSC可在载VEGF微球上生长和增殖;DPSC和载VEGF微球体内形成牙髓样组织,长约9.0 mm,充满根管的根尖1/3和根中1/3,可达冠1/3,伴血管分布和成牙本质细胞样细胞分化.结论 载VEGF微球和DPSC可在体内促进牙髓再生和血管形成.
