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转化生长因子β3基因多态性与唇腭裂关联的核心家庭分析
目的 探讨中国部分地区人群非综合征型唇裂伴或不伴腭裂(nsCL/P)与转化生长因子β3基因CA重复序列多态性之间的关系.方法 采用PCR-单链构象多态性方法,对170个nsCL/P核心家庭成员DNA标本进行TGFβ3 CA重复序列多态性的检测.利用传递不平衡检验(TDT)、基于单体型的单体型相对危险度检验(HHRR)和运用家系为基础的相关性检验(FBAT)检验分析该突变与nsCL/P发生之间的关系.结果 TDT(OR=1.38,95%CI 0.93～2.06)和HHRR(OR=1.31,95%CI 0.93～1.84)检验发现,TGFβ3 CA重复序列多态性与nsCL/P发生之间的关联不具有统计学意义(P>0.05),但是FBAT检验发现在显性和隐性模型中,TGFβ3基因多态性与nsCL/P发病危险之间的关联具有统计学意义(P<0.05).结论 TGFβ3 CA重复序列多态性可能是中国部分地区人群发生nsCL/P的危险因素,但还有待于扩大样本量进一步加以验证.
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电针对慢性应激抑郁大鼠海马转化生长因子β3和碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
目的:观察电针对慢性应激模型大鼠海马转化生长因子β3(TGF-β3)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达的影响,探讨电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经的营养再生作用.方法:雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、氟西汀组,每组10只.除空白组外,其余组均采用慢性应激结合孤养方法造模28d.电针组于造模前1h选取“百会”“印堂”穴进行电针,氟西汀组于造模前1h给予盐酸氟西汀混悬液5 mL/kg灌胃治疗.通过旷场实验对大鼠进行行为学评价,采用生物素标记抗体芯片技术筛选出海马中差异蛋白TGF-β3、bFGF.结果:造模结束后,与空白组相比,模型组大鼠水平穿越格数、竖立次数均显著减少(P＜0.01);与模型组相比,电针组和氟西汀组大鼠水平穿越格数、竖立次数均显著增加(P＜0.01).与空白组比较,模型组大鼠海马TGF-β 3蛋白水平下降(fold change=0.48),bFGF蛋白水平上升(fold change=1.36);与模型组比较,电针组、氟西汀组TGF-β3蛋白水平上升(fold change=1.61,1.61),bFGF蛋白水平下降(fold change=0.61,0.45).结论:电针可能通过上调TGF-β3蛋白表达水平参与促进神经血管的营养再生,并且良性调节具有神经保护作用的bFGF,使其趋于正常水平,从而改善慢性应激抑郁模型大鼠的行为学症状,这可能是针刺抗抑郁作用的分子机制之一.
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双基因转染兔骨髓基质干细胞与胶原／羟基磷灰石复合修复骨缺损及对假体-骨界面整合的影响
目的构建假体周围骨缺损模型，将慢病毒介导的骨形态发生蛋白2（ BMP-2）和转化生长因子β3（TGF-β3）双基因转染兔骨髓基质干细胞（MSCs）与胶原/羟基磷灰石复合，后植入假体周围，观察其对假体-骨界面骨整合的影响。方法成年健康清洁新西兰白兔24只，雌雄不限，体重2.5～3.5 kg，于两侧股骨髁间造成纵向骨缺损，植入光滑钛合金假体后保持骨假体周围2 mm骨缺损，共48侧，实验组（左侧）及对照组（右侧）各24侧，采用压缩植骨技术，重建股骨髁假体周围骨缺损，分别植入组织工程骨（双基因组）、单纯胶原/羟基磷灰石（细胞组），打压紧密并完全覆盖植入体。于术后4、8、12周时麻醉法分别处死8只兔子，行大体观察、X线观察、组织形态计量学及生物力学测定评估组织工程化骨修复骨缺损的能力及对假体-骨界面骨整合的作用。结果术后4周，对照组、实验组X线表现无显著差别，假体周围主要为纤维结缔组织，假体骨结合强度分别为0.3388±0.7206，0.6845±0.7186，差异有统计学意义（ P＜0.01），假体骨接触率均为0；术后8周，实验组X线表现见假体周围有新骨形成，对照组、实验组假体骨结合强度分别为0.6468±0.7852，1.1824±0.0800，假体骨接触率分别为（5.93±0.60）％，（23.35±3.76）％，二者差异均有统计学意义（ P＜0.01）；术后12周实验组X线表现见假体周围为骨组织，组织学所见植入体周围为连续性骨接触，对照组、实验组假体骨结合强度分别为1.4419±0.1021，2.7622±0.1802，假体骨接触率分别为（15.27±2.34）％，（39.76±1.85）％，假体结合强度与假体骨接触率均高于对照组，差异均有统计学意义（ P＜0.01）。对照组、实验组假体骨结合强度及假体骨界面骨接触率随着时间的延长而增大，术后8周与4周比较，术后12周与8周比较，数值均增高，有显著性差异（ P＜0．01）。结论组织工程化骨修复假体周围骨缺损，可促进假体周围新骨形成，提高假体-骨界面骨整合，改善假体稳定性。
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慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化
目的：重组慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染兔骨髓间充质干细胞，诱导其软骨细胞分化，与TGF-β3单基因转染诱导其软骨细胞分化的效率作比较。方法全骨髓贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测细胞表面抗原，培养后通过重组慢病毒分别转染阴性对照（N组）、TGF-β3单基因（T组）、TGF-β3/BMP-2联合基因（TB组），培养14 d后，荧光显微镜下观察各组细胞形态，RT-PCR、Western blot分别检测SOX-9、蛋白多糖、Ⅱ型胶原在基因水平与蛋白水平的表达量。结果流式细胞术检测造血干细胞标志物（CD34，2.07%）、白细胞表面抗原（HLA-DR，1.73%）均为阴性，透明质酸受体（CD44，82.79%）为阳性，荧光显微镜观察诱导后细胞形态多为多角形、方形或者类圆盘状，RT-PCR、Western blot结果均示T组、TB组SOX-9、蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达量均比空白对照组（C组）、N组高（P＜0.05），且TB组表达量高于T组（P＜0.01）。结论 TGF-β3/BMP-2联合基因转染骨髓间充质干细胞能诱导其成软骨细胞分化，且联合基因转染效率高于TGF-β3单基因转染。
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转化生长因子β3与创面愈合
TGFβ3是TGFβs家族中重要的成员之一.体内几乎所用的组织或细胞都能合成和释放TGFβ3,并表达其膜受体.近研究发现,TGFβ3广泛参与和调节细胞增生和分化,在创伤愈合,包括调节细胞外基质的合成和终减轻瘢痕的形成中有重要的作用[1].
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骨形态生成蛋白2联合转化生长因子β3诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究
背景:髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPSCs)在椎间盘损伤退变修复中具有重要应用价值,诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化是关键步骤.目的:探讨联合使用骨形态生成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和转化生长因子β3 (transforming growth factor β3,TGF-β3)诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的可行性及效果.方法:取3月龄大鼠尾椎髓核组织,分离培养髓核间充质干细胞,并进行形态学观察、三系分化鉴定和流式细胞术检测干细胞表面抗原.将培养获得的NPSCs分为4组,对照组、20 ng/ml TGF-β3组、100 ng/mlBMP-2组和20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组,分别加入不同组合的细胞因子对NPSCs进行诱导培养.采用CCK-8增殖实验检测各组细胞因子毒性,在诱导第7天、第14天提取mRNA进行实时定量RT-PCR检测各组髓核特异基因Aggrecan、SOX-9、Collagen-2、Krt19的相对表达量;在诱导第14天进行阿利新蓝染色检测细胞外基质的表达量,对比各组染色强度来比较各组NPSCs分化程度.结果:成功从髓核组织分离NPSCs并进行鉴定.原代细胞培养11d后传至P3代,贴壁细胞呈纺锤长梭形,旋窝样生长.CCK-8实验结果显示,加入细胞因子组细胞增殖水平在培养3d后较对照组升高,但3组之间无统计学差异,排除由细胞增殖导致的胞外基质增多.RT-PCR结果显示,在诱导第7天时加入细胞因子组髓核特异基因的表达较对照组均升高(P＜0.05),在第14天时,20 ng/ml TGF-β3+ 100 ng/ml BMP-2组髓核特异基因的表达较20 ng/ml TGF-β3组和100 ng/ml BMP-2组升高(P＜ 0.05).阿利新蓝染色结果显示,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组细胞外基质分泌明显高于其他组.结论:联合使用TGF-β3和BMP-2能够有效诱导NPSCs向类髓核细胞分化,可为下一步应用NPSCs治疗椎间盘退变打下基础.
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AAV-TGFβ3的构建及其与AV-TGFβ1表达系统对反分化髓核细胞蛋白多糖合成的影响
目的:比较转化生长因子(TGF)β3腺相关病毒(AAV-TGFβ3)与TGFβ1腺病毒(AV-TGFβ1)表达系统对反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖合成的生物学效应.方法:制备具有感染活性的AAV-TGFβ3并采用酶切电泳和免疫荧光对其进行鉴定.将AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1分别转染反分化早、晚期髓核细胞,采用免疫印迹法检测TGFβ3和TGFβ1蛋白的表达,并通过Antonopulos法分别检测AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1对蛋白多糖合成的生物学效应.结果:AAV-TGFβ3转染可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ3蛋白的表达,并促进其蛋白多糖的合成.转染后第12天,蛋白多糖含量达到峰值,分别为0.399±0.029和0.152±0.011,此后蛋白多糖含量缓慢降低;于转染后第2个月,蛋白多糖含量稳定在较高水平,分别为0.309±0.021和0.115±0.009.AV-TGFβ1转染亦可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ1蛋白的表达,但其仅促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,转染后第10天蛋白多糖含量达到峰值(0.413±0.041),此后蛋白多糖含量快速降低,转染后第2个月时蛋白多糖含量降至较低水平(0.198±0.013);对于反分化晚期髓核细胞,AV-TGFβ1则抑制其蛋白多糖的合成.结论:AAV-TGFβ3可稳定地促进反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖的合成;AV-TGFβ1仅一过性地促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,而且抑制反分化晚期髓核细胞蛋白多糖的合成.
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rAAV2-TGFβ3对肝纤维化大鼠肝脏组织胶原降解的影响
目的 通过重组2型腺相关病毒(rAAV2)和基因转导,探讨转化生长因子β3(TGFβ3)对肝纤维化大鼠肝脏组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原表达的影响.方法 将实验大鼠随机分为正常对照组、模型组、阴性对照组和TGFβ3,干预组.用40%的四氯化碳(CCl4)复制大鼠肝纤维化模型.在CCl4诱导前1周,将rAAV2-TGFβ3注入大鼠尾静脉.造模8周后处死大鼠,取肝脏组织做HE染色观察肝脏组织学改变;免疫组织化学染色观察MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达,并对其阳性面积比进行半定量分析.结果 TGFβ3干预组与模型组和阴性对照组比较,肝脏组织炎性浸润明显减轻,纤维间隔增生减少,MMP-9的表达明显增加(q=23.664、27.746,P值均<0.01),Ⅰ型胶原(q=5.503、5.251,P值均<0.01)和TIMP-1(q=5.800、8.608,P值均<0.01)的表达明显下降,但MMP-2表达的差异无统计学意义(q=2.108、0.996,P值均>0.05).结论 rAAV2-TGFβ3可通过抑制大鼠肝脏组织内TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达,促进MMP-9的表达,增加胶原纤维的降解,减轻肝脏组织学损伤和纤维化程度.
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TGFβ1和β3基因对大鼠肝星状细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响
目的 观察重组转化生长因子β1(TGFβ1)和β3(TGFB3)基因对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响.方法 (1)构建质粒pcDNA3.1(+)-TGFB,和peDNA3.1(+)-TGFβ3;(2)瞬时转染:将pcDNA3.1(+)-TGFβ1和peDNA3.1(+)-TGFβ3分别及共同转染HSC-T6细胞,荧光定量PCR法和免疫印迹法检测转染后24、48和72 h时MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白的表达;(3)稳定转染:pcDNA3.1(+)-TGFβ1转染HSC-T6细胞,经筛选建立高表达TGFβ1的HSC-T6细胞克隆,pcDNA3.1(+)-TIGFβ3转染细胞克隆,48 h后检测MMP-2、MMP-9和T1MP-1的表达.结果 (1)TGFβ1转染细胞后,MMP-2和TIMP-1明显增高(P＜0.05),MMP-9无变化;TGFβ3转染细胞后,MMP-2和MMP-9无变化,TIMP-1 mRNA也无变化,但TIMP-1蛋白明显增高(P＜0.05);共转染组的MMP-2较空白组和对照组明显增加(P＜0.05),MMP-9无改变,TIMP-1较TGFβ1转染组明显下降(P＜0.05).(2)TGFβ3转染克隆细胞后,MMP-2无明显变化,MMP-9明显增加(P＜0.05),TIMP-1明显下降(P＜0.05).结论 重组TGFβ3基因可能通过促进MMP-2或MMP-9的活性和抑制TIMP-l的活性而发挥抗肝纤维化作用.
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不同浓度胰岛素样生长因子-1和转化生长因子β-3对人肌腱细胞存活和胶原合成的影响
目的 为肌腱组织工程筛选出一种优化的人肌腱细胞培养基,即使在不添加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的条件下,通过优化培养基构成维持其存活并分化.方法 在α-MEM培养基中,加入佳组合的生长因子(growth factors,GF),同时加入不同浓度的FBS(0、1％、5％和10％)和不同浓度的IGF-1(0、10、50 ng/ml),TGFβ-3 (0、1、10 ng/ml),用拉马拉蓝染色法检测人肌腱细胞的生存情况、增殖速度,用天狼星红定量胶原合成.结果 在无FBS情况下,含有10 ng/ml TGFβ-3和50 ng/ml IGF-1两种生长因子的α-MEM培养基中培养14 d后,人肌腱细胞依旧存活(6228.68±43.87),高于其他实验组,但低于10％ FBS对照组(13 576.74±286.75,t=41.29,P＜0.05),胶原合成量[ (0.322 ±0.003) ng]明显大于未添加生长因子组(t=4.13 ～5.93,P＜0.05).结论 添加50 ng/ml IGF-1和10 ng/ml TGF3-3优化的α-MEM培养基可维持人肌腱细胞存活长达14 d并促进肌腱细胞分化,而不必添加FBS.
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TCDD诱导的胎鼠腭裂发生过程中TGF-β3、Dnmts启动子区CpG岛甲基化状态研究
目的 研究2,3,7,8-四氯二苯二噁英(2,3,7,8-tetrachlrodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱导的胎鼠腭发育过程中转化生长因子β3(transforming growth factor beta 3,TGF-β3)、DNA甲基转移酶(DNA methyhransferases,Dnmts)基因启动子区CpG岛甲基化状态与TGF-β3、Dnmts表达量的相关性.方法 将18只C57BL/6J孕鼠完全随机分为TCDD组和对照组,每组各9只.TCDD组于妊娠第10.5天(gestation day,GD10.5)给予28 μg/kg的TCDD口服,对照组给予等体重体积的玉米油口服.分别于GD13.5、14.5、15.5处死孕鼠,收集2组胎鼠腭突组织.通过试剂盒进行基因组DNA提取、亚硫酸氢盐转化、甲基化特异性PCR,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分析2组各时间点腭组织表达的TGF-β3、Dnmts启动子CpG岛甲基化状态.应用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析,两样本间均数比较均采用独立样本t检验,所有结果作K-S检验均符合正态分布,方差不齐者采用校正t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义.结果 2组各时间点TGF-β3启动子区CpG岛均处于低甲基化水平,TCDD组和对照组GD13.5、GD14.5、GD15.5甲基化程度分别为(8.6±0.8)％和(8.7±0.8)％、(1 1.5±1.4)％和(11.7±1.0)％、(12.0±0.7)％和(12.1±0.5)％,相同时间点TCDD组与对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).Dnmt1启动子区CpG岛均处于高甲基化水平,TCDD组和对照组GD13.5、GDI4.5、GD15.5甲基化程度分别为(73.9±1.1)％和(72.6±0.8)％、(70.8±1.7)％和(70.7±1.0)％、(69.4±2.2)％和(69.7±0.5)％,相同时间点TCDD组与对照组间差异亦无统计学意义(P＞0.05).TCDD组Dnmt3a启动子区CpG岛1的甲基化水平在GD13.5和GD15.5高于对照组,分别为(21.9±1.1)％和(8.1±0.6)％(P＜0.01)、(43.4±0.4)％和(32.9±0.7)％(P＜0.01),在GD14.5低于对照组,分别为(33.2±0.5)％和(42.9±0.3)％(P＜0.01).对照组Dnmt3a启动子区CpG岛2的甲基化水平在各时间点均高于TCDD组,GD13.5、GD14.5、GD15.5甲基化程度分别为(82.0±0.7)％和(32.3±0.6)％(P＜0.01)、(62.7±1.0)％和(25.5±1.4)％(P＜0.01)、(47.2±0.4)％和(30.3±1.4)％(P＜0.01).结论 TCDD诱导的胎鼠腭发育期间Dnmt3a启动子区接近第1外显子处CpG岛2的低甲基化水平,可能是Dnmt3a基因在GD13.5高表达的原因,并因此诱发胎鼠腭裂的基因组呈高甲基化状态.TGF-β3和Dnmt1启动子区CpG岛甲基化状态与TCDD作用无关.
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pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究
目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)/TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响.方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)/TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RT-PCR与Western blot检测hTGβ3在真核细胞中的表达.经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性.结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3 mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达.TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P＜0.05).结论pcDNA3.1(-)/TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖.
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转化生长因子β3联合牙髓干细胞在种植体周围早期骨结合中的作用
目的 建立兔下颌骨前牙区种植修复动物实验模型,探讨转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β3联合体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)在兔种植体周围骨结合中的作用.方法 将实验新西兰兔按随机数字表随机分为实验组、对照组和空白组,每组6只,在实验组的种植体与骨间隙内充填TGF-β3、DPSC、人工骨粉的混合物,在对照组的种植体与骨间隙内充填DPSC、人工骨粉的混合物,在空白组的种植体与骨间隙内充填磷酸盐缓冲液和人工骨粉的混合物.术后2周处死各组动物,观察游离下颌骨并对种植体周围骨组织进行HE染色和免疫组化染色,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达水平.结果 种植体植入后均无脱落、松动.HE染色结果显示空白组可见种植体周围骨小梁稀疏,未见明显新骨形成,少量血管;对照组可见种植体周围骨小梁较稀疏、纤细,成骨细胞呈线状排列在骨小梁周围,少量新骨形成;实验组可见种植体周围骨小梁较多,其粗大且致密,成骨细胞呈密集成团排列、功能活跃被基质包裹,新骨形成较多,可观察到典型的骨陷窝、骨细胞并伴有大量新生血管.免疫组织化学结果显示实验组、对照组、空白组骨涎蛋白的平均阳性面积所占比例分别为(24.6±5.3)％、(11.3±2.8)％及(7.6±3.8)％.实验组骨涎蛋白呈强阳性表达,明显高于其他两组(P=0.000,P=0.000 ).实时荧光定量PCR结果显示实验组RUNX相关转录因子2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶基因的表达水平均高于空白组和对照组,且差异均有统计学意义(P=0.023).结论 TGF-β3具有促进DPSC向成骨细胞转化的潜能,能增加成骨细胞的数量并促进种植体周围骨结合,为解决临床种植骨愈合时间过长等问题提供新思路.
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低氧条件下转化生长因子-β3促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化的分析
目的 探索低氧环境下转化生长因子-β3(TGF-β3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向软骨细胞分化的作用及相关机制.方法 取SD大鼠的胫骨、股骨,运用全骨髓贴壁法培养BM-MSCs,通过流式细胞术检测其细胞表面抗原、定向诱导分化等方式鉴定BM-MSCs;在常氧或低氧条件下,添加TGF-β3诱导BM-MSCs,阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色检测BM-MSCs的软骨表达情况;实时荧光定量聚合酶链反应检测软骨Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ)、聚蛋白多聚糖(aggrecan)、Ⅹ型胶原蛋白(collagenⅩ)的表达情况;蛋白免疫印迹法分别检测collagenⅡ、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及β-连环蛋白的表达情况.结果 BM-MSCs呈成纤维细胞状,细胞表面高表达CD90(99.26%),CD29(96.41%),CD44(95.98%),弱表达CD45(8.8%)并可诱导向成骨、成脂、成软骨分化;阿利新蓝及细胞免疫荧光染色的结果发现低氧条件下添加TGF-β3培养BM-MSCs细胞团高表达aggrecan和collagenⅡ.实时荧光定量聚合酶链反应的结果发现,对比对照组,低氧条件下添加TGF-β3可使BM-MSCs的collagenⅡ、aggrecan和collagenⅩ的mRNA水平分别上调2.46、2.20和1.80倍(P<0.05).蛋白免疫印迹法提示低氧TGF-β3组较对照组HIF-1α、collagenⅡ表达量增加,β-连环蛋白表达量下降.结论 低氧环境下TGF-β3可以明显促进BM-MSCs成软骨分化能力,并可能与抑制Wnt/β-catenin通路相关,从而为BM-MSCs治疗关节软骨损伤提供有效的新途径.
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外源性TGF-β3对大鼠肝星状细胞TGF-β3启动子活性和CREB-1的影响
目的 观察转化生长因子β3(TGF-β3)自反馈调节信号通路中正向调节因子的作用.方法 用外源性TGF-β3诱导大鼠肝星状细胞系(HSC-T6),在不同时间点用荧光素酶报告基因分析法检测TGF-β3的启动子活性,Western印迹法检测cAMP反应元件(CRE)结合蛋白1(CREB-1)和磷酸化CREB-1的表达,实时荧光定量PCR法检测CREB-1 mRNA的表达情况.结果 外源性TGF-β3处理HSC-T6后,TGF-β3启动子活性表现出时间依赖性增高,并于诱导后24 h达峰值[10.68±0.57,2.2倍于对照组(4.83±0.56)].TGF-β3启动子的基础活性下降了85%(0.73±0.03,P＜0.05).外源性TGF-β3可在短时间内上调磷酸化CREB-1的表达,与对照组(比值为1)相比,15 min即可见明显增加(1.5倍于对照组),1 h时其表达量达到大值(2.0倍于对照组),12 h略见下降(1.9倍于对照组,均P＜0.05).外源性TGF-β3对HSC-T6中CREB-1 mRNA和CREB-1蛋白的表达均无影响(均P＞0.05).结论 外源性TGF-β3可促进TGF-β3启动子活性增强,且CRE位点在外源性TGF-β3介导的TGF-β3启动子活性中发挥重要作用;外源性TGF-β3可活化CREB-1,但不能促进CREB-1蛋白及mRNA的表达.
关键词： 肝硬化 转化生长因子β3 cAMP反应元件结合蛋白质 -
电磁脉冲辐照对小鼠睾丸组织凋亡和转化生长因子β3表达的影响
目的 观察电磁脉冲对小鼠睾丸组织凋亡和小鼠睾丸组织中转化生长因子(TGF)-β3表达的影响.方法 32只雄性BALB/c小鼠随机分为辐照组(接受场强200 kV/m,脉冲次数分别为100、200和400次的电磁脉冲全身辐照)和对照组(不做任何处理),每组8只.用TUNEL法观察电磁脉冲对小鼠睾丸组织结构及凋亡的影响;RT-PCR、免疫荧光组织化学和Western blot测定电磁脉冲对小鼠睾丸组织中TGF-β3 mRNA和蛋白表达水平的影响.结果 100次和200次脉冲辐照后小鼠睾丸组织未见明显的病理变化,400次脉冲辐照后小鼠睾丸组织出现变性、脱落并引起小鼠睾丸组织凋亡率明显增加(P＜0.05);Western blot结果显示,一定强度的电磁脉冲可引起小鼠睾丸组织TGF-β3表达增高,400次脉冲组表达明显增高(P＜0.05);RT-PCR结果表明,400次脉冲辐照可引起小鼠睾丸组织TGF-β3 mRNA明显增加(P＜0.05).结论 电磁脉冲辐照引起小鼠睾丸组织凋亡增加和TGF-β3表达增高,可能是电磁脉冲致小鼠血睾屏障通透性增加的机制之一.
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压力性尿失禁大鼠阴道壁及肛提肌组织TGFβ-3,Lamin,Relaxin的表达
目的:探讨转化生长因子β-3 (TGFβ-3)、层黏连蛋白(Lamin)和松弛素(Relaxin)mRNA的表达与压力性尿失禁(SUI)鼠发病的关系.方法:分别提取SUI模型鼠与正常大鼠(各8只)的阴道前壁及肛提肌组织,提取组织中RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别测定上述3种因子含量的变化.结果:SUI大鼠与正常大鼠比较,阴道前壁和肛提肌中TGFβ-3 mRNA和Lamin mRNA的表达明显降低,Relaxin mRNA的表达明显增高,差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:SUI的发生与阴道前壁及肛提肌组织中TGFβ-3、Lamin表达减少、Relaxin表达增多有关.
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TGF-β3通过抑制上皮间质转化拮抗放射性肺纤维化
目的 检测分析放射性肺纤维化过程中上皮间质转化(EMT)情况,探索转化生长因子β3(TGF-β3)是否通过EMT途径抑制放射性肺纤维化的发生.方法 将180只C57BL/6雌性小鼠按体重完全随机分为对照组、单纯照射组(简称照射组)和照射+TGF-β3组(简称TGF-β3组),照射组和TGF-β3组经20 Gy 60Co γ射线单次胸部照射后,分别腹腔注射0.5 mL 0.9％的生理盐水和TGF-β3(1 μg/kg),每周1次,于照射后1、3和6个月活杀,用苏木素-伊红(HE)染色、Masson三色染色后观察肺组织病理学改变,用免疫组化法检测肺组织EMT相关的上皮标志物紧密连接蛋白(ZO-1)和间质标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)的表达,用Mann-Whitney U秩和检验和Fisher确切概率法对结果进行统计分析.结果 HE和Masson染色结果显示,照射能够引起小鼠肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积等典型纤维化病理改变;照射后3和6个月,与照射组比较,TGF-β3组小鼠肺纤维化病变明显减轻,差异有统计学意义(Z=-2.562、-2.807,均P＜0.05),胶原沉积显著减少,差异有统计学意义(Z=2.442、2.529,均P＜0.05).免疫组化结果显示,与对照组比较,照射后1、3和6个月,小鼠肺组织ZO-1的表达量明显减少,差异有统计学意义(Z=4.492、5.831、6.064,均P＜0.05),N-cadherin的表达量显著增高,差异有统计学意义(Z=-3.269、-5.520、-6.063,均P＜0.05);与照射组比较,TGF-β3组ZO-1表达量显著增高,差异有统计学意义(Z=-2.881、-4.220、-5.695,均P＜0.05),而N-cadherin表达量显著减少,差异有统计学意义(Z=4.546、3.560、4.919,均P＜0.05).结论 TGF-β3可通过抑制EMT拮抗放射性肺纤维化.
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二噁英诱导胎鼠腭裂组织中TGF-β3表达变化
目的 探讨转化生长因子( TGF-β3)在2,3,7,8-四氯二噁英(TCDD)诱导C 57 BL/6 J胎鼠腭裂发生中的作用.方法 在小鼠怀孕第10 d(GD 10),二噁英组以TCDD 64 μg/kg灌胃,对照组以玉米油16 mL/kg灌胃,于GD 18.5解剖显微镜下观察胎鼠腭裂发生率,并于GD 13.5、14.5、15.5剪取胎鼠腭突组织提取RNA及蛋白,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和western blot分别检测腭突组织中TGF-β 3 mRNA和TGF-β 3蛋白表达情况.结果 二噁英组腭裂发生率为100% (39/39),对照组无腭裂发生(0/42)；在GD 13.5、14.5、15.5时,二噁英组TGF-β 3 mRNA相对表达量分别为(0.392±0.056)、(0.467±0.064)、(0.192±0.032),明显高于对照组(0.081±0.020)、(0.178±0.011)、(0.113±0.016)(P＜0.05)；二噁英组TGF-β 3蛋白相对表达量分别为(0.046±0.009)、(0.089±0.015)、(0.028±0.003),明显高于对照组(0.017±0.001)、(0.039±0.003)、(0.005±0.001) (P ＜0.05).结论 TCDD可诱导C 57 BL/6 J胎鼠形成腭裂,并明显上调胎鼠腭突组织中TGF-β3表达.
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人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测
背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效.目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒.方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1.转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平.结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48 h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%.说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒.
