首页 > 文献资料
-
骨形态生成蛋白2联合转化生长因子β3诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究
背景:髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPSCs)在椎间盘损伤退变修复中具有重要应用价值,诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化是关键步骤.目的:探讨联合使用骨形态生成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和转化生长因子β3 (transforming growth factor β3,TGF-β3)诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的可行性及效果.方法:取3月龄大鼠尾椎髓核组织,分离培养髓核间充质干细胞,并进行形态学观察、三系分化鉴定和流式细胞术检测干细胞表面抗原.将培养获得的NPSCs分为4组,对照组、20 ng/ml TGF-β3组、100 ng/mlBMP-2组和20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组,分别加入不同组合的细胞因子对NPSCs进行诱导培养.采用CCK-8增殖实验检测各组细胞因子毒性,在诱导第7天、第14天提取mRNA进行实时定量RT-PCR检测各组髓核特异基因Aggrecan、SOX-9、Collagen-2、Krt19的相对表达量;在诱导第14天进行阿利新蓝染色检测细胞外基质的表达量,对比各组染色强度来比较各组NPSCs分化程度.结果:成功从髓核组织分离NPSCs并进行鉴定.原代细胞培养11d后传至P3代,贴壁细胞呈纺锤长梭形,旋窝样生长.CCK-8实验结果显示,加入细胞因子组细胞增殖水平在培养3d后较对照组升高,但3组之间无统计学差异,排除由细胞增殖导致的胞外基质增多.RT-PCR结果显示,在诱导第7天时加入细胞因子组髓核特异基因的表达较对照组均升高(P＜0.05),在第14天时,20 ng/ml TGF-β3+ 100 ng/ml BMP-2组髓核特异基因的表达较20 ng/ml TGF-β3组和100 ng/ml BMP-2组升高(P＜ 0.05).阿利新蓝染色结果显示,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组细胞外基质分泌明显高于其他组.结论:联合使用TGF-β3和BMP-2能够有效诱导NPSCs向类髓核细胞分化,可为下一步应用NPSCs治疗椎间盘退变打下基础.
-
辛伐他汀对大鼠髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响
目的:观察大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,NPMSC)的生物学特性和辛伐他汀对髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响.方法:取8周龄SD大鼠尾椎髓核组织,采用胶原酶及胰酶序贯消化法分离NPMSC并进行体外扩增培养,观察细胞形态并通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况.通过流式细胞仪检测细胞免疫表型及逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测干细胞基因表达进行NPMCS的鉴定.取第3代NPMSC施加不同浓度辛伐他汀干预(0μmol/L 、0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1 μmol/L),在干预1d、3d、7d、14d、21d后通过CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA表达.结果:原代细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长,传代后细胞生长较原代细胞明显加快,细胞形态以纺锤形为主.第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD45及CD11b,与骨髓间充质干细胞具有相似的干细胞转录因子Sox2、Oct-4及Nanog表达水平.适当浓度的辛伐他汀(0.01 μmol/L～0.1 μmol/L)可促进NPMSC增殖及HIF-1α 、GLUT-1、VEGF的mRNA表达,且浓度为0.1μmol/L时达到强,而高浓度辛伐他汀(1tμmol/L)对细胞增殖能力及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达有明显抑制作用.辛伐他汀可使NPMSC中出现并促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达,0.1μmol/L浓度达到强.结论:大鼠的髓核组织培养出的NPMSC能够表达骨髓间充质干细胞特异性的干性基因,适当浓度(0.01 μmol/L～0.1μmol/L)的辛伐他汀可促进NPMSC增殖和细胞外基质的分泌.
-
酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响
目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制.方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态.取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力.按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定.在37℃、21％O2、5％CO2的细胞培养箱中用不同pH值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10％血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同pH值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA表达情况.结果:P0代细胞均贴壁生长.P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、95％、94％以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4％).茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化.按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs.细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P＞0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P＜0.05),且pH值越低细胞的OD值越小.pH值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P＜0.05).pH值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA均明显高于pH值7.1、6.8、6.5、6.2组(P＜0.05).随着培养液pH值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的mRNA表达降低.结论:低pH值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着pH降低作用越明显.
-
正常与退变髓核的髓核间充质干细胞代谢活性及干性基因表达的比较
目的：比较来源于正常与退变髓核的髓核间充质干细胞（NPMSCs）的细胞代谢活性及干性基因表达情况。方法：收集6例非退变患者髓核组织（正常组）与6例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织（退变组），采用酶消化法分离细胞，应用标准间充质干细胞培养基（standard MSC culture medium）进行细胞培养并观察细胞形态。两组内各取1例分离得到的细胞进行流式细胞仪检测间充质干细胞表面蛋白分子标记CD90、CD105、CD73、CD45、CD34及人类白细胞抗原（HLA）-DR表达情况；并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化，诱导28d后分别应用茜素红染色鉴定细胞成骨能力、油红O染色鉴定细胞成脂能力、甲苯胺蓝染色鉴定细胞成软骨分化能力，并按照国际干细胞治疗协会（ISCT）提出的间充质干细胞的判定标准，对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。采用CCK-8检测两组P2代NPMSCs的代谢活力。提取两组每例P2代细胞总RNA，行RT-PCR检测P2代细胞“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达情况。结果：两组P0代细胞均贴壁生长，形态学方面两组并无明显差异。免疫表型鉴定显示正常组和退变组间充质干细胞表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、98％、95%以上，两组均低表达造血细胞标志物CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实正常组与退变组细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。上述结果证实分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后5d、7d、9d、11d、13d正常组细胞活性均强于退变组，两组细胞活性有统计学差异（P<0.05）。正常组“干性维持”相关基因Oct4及Nanog表达量分别为退变组的4.63±1.17、7.36±1.19倍，正常组均明显高于退变组（P<0.05）。结论：正常与退变髓核组织内均存在NPMSCs，但正常椎间盘来源的NPMSCs具有较强的细胞代谢活性，较”强的“干性维持”基因表达。
-
人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及生物学活性鉴定
目的:探索人髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)的提纯方法并鉴定其生物学活性.方法:收集3例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织(Pfirrmann分级均为Ⅳ级),利用酶消化法分离细胞.采用两种方法分离提纯NPMSCs,一组细胞采用贴壁法培养(贴壁组),另一组通过流式细胞分选技术利用NPMSCs表面阳性标志物CD73、CD90、CD105获得NPMSCs(流式组).将两种方法获得的NPMSCs进行体外培养扩增,分别进行形态学观察,细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit,CCK-8)检测增殖能力.贴壁组NPMSCs采用流式细胞分选仪在进行分选之前检测免疫表型,流式组NPMSCs在生长达80％～90％融合时进行免疫表型的检测.向成骨、成脂、成软骨诱导分化,诱导28d后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红O染色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力,利用Imag J软件计算染色区域所占的面积百分比.比较两组NPMSCs在形态学、免疫表型及增殖和分化能力的差异.结果:形态学观察发现,两组NPMSCs均呈漩涡状生长,贴壁组NPMSCs可见散在的单个细胞生长;流式组NPMSCs长梭形形态更长,排列更加紧密,少见散在的单个贴壁生长细胞.流式细胞分选后所得的NPMSCs占细胞总数的(89.67±2.52)％,可以进行体外培养扩增,细胞为典型的长梭形特征,漩涡状生长,在接种后12～15d达80％～90％融合,增殖能力在接种后5～13d明显高于贴壁组NPMSCs (P＜0.05).流式组NPMSCs的CD73、CD90、CD105的表达率明显高于贴壁组NPMSCs(P＜0.05),并且低表达CD34、CD45及HLA-DR.两种方法获得的NPMSCs均能完成三系诱导分化,流式组成骨、成脂、成软骨染色区域百分比均明显高于贴壁组(P＜0.05).结论:利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中可获得较高纯度的NPMSCs,并能进行后续培养扩增.与贴壁法获得的NPMSCs相比,流式细胞分选的NPMSCs具有更强的增殖与分化能力.
-
不同体积浓度胎牛血清对大鼠髓核间充质干细胞生物学特性的影响
目的：研究大鼠髓核间充质干细胞（NPMSCs）体外培养的佳血清体积浓度并探讨椎间盘退变的机制。方法用胶原酶、胰酶序贯消化法从SD大鼠腰部和尾部的椎间盘组织中提取NPMSCs，并进行体外培养，将其传代。①利用流式细胞仪对第3代传代NPMSCs细胞表型CD29、CD34、CD24、CD90、CD105进行鉴定；②利用普通PCR鉴定体外培养的NPMSCs细胞基因Sox2、Nanog的表达；③在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养第3代传代NPMSCs，2周以后，用染色剂对其染色，观察其成脂、成骨、成软骨能力。④在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同血清体积浓度（0%、5%、10%、20%、30%）的 DMEM-F12血清培养液培养第3代传代 NPMSCs，72h 后利用CCK-8法检测细胞的增殖，并采用RT-PCR检测细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9的mRNA表达，借助流式细胞仪对细胞进行细胞凋亡的检测。结果①大鼠NPMSCs的成骨、成软骨能力强，成脂能力较差，且其细胞表面高度表达CD29、CD90、CD105，低度表达CD24、CD34，细胞基因 Sox2、Nanog 高度表达。②随着培养液血清体积浓度增加， OD 值增大， NPM-SCs的凋亡率降低，细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9基因的mRNA表达增加。结论①大鼠NPMSCs具有间充质干细胞特性；②细胞外营养影响大鼠NPMSCs的增殖、分泌、凋亡。
-
家兔髓核间充质干细胞的体外培养与鉴定
①目的 建立家兔腰椎髓核间充质干细胞(NPMSCs)体外培养模型并对其进行鉴定,为进一步研究椎间盘退变提供理论依据.②方法 首先用酶消化法得到家兔原代髓核细胞,再将其加入间充质干细胞完全培养基中分离出NPMSCs并进行传代培养,观察NPMSCs的细胞学及生物学特性.后进行细胞鉴定:运用流式细胞术检测家兔NPMSCs的细胞表面免疫表型CD105、CD90、CD34、CD45的表达情况;运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测间充质干细胞基因SOX2、Nanog的表达.③结果 家兔髓核组织来源细胞在原代培养4～6天后即可见部分细胞贴壁生长,形态为短梭形或多角形.传代后细胞增殖速度明显加快,到第三代可见细胞大多为长梭形,待细胞达到90％ 融合时,可见细胞呈漩涡状生长.通过流式细胞术检测所培养细胞的表面免疫分子标志:CD105、CD90阳性表达,CD34、CD45阴性表达;运用RT-PCR检测所培养细胞可表达干细胞基因SOX2、Nanog.④结论 成功在体外培养出家兔NPMSCs,为研究椎间盘退变的发生发展机制打下基础.
-
脂肪与髓核来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞分化
背景：大量研究表明多种组织来源的成体干细胞在体外均可向类髓核细胞分化。椎间盘髓核组织来源间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下能否向类髓核细胞分化？其分化能力与脂肪间充质干细胞相比是否有差异目前未见报道。目的：比较脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞在转化生长因子β1诱导下向类髓核细胞诱导分化能力的差异。方法：分别取大鼠腹股沟处脂肪组织与尾段脊柱，采用机械酶消化法分离培养脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞。流式细胞仪检测两种细胞 CD105、CD90、CD29、CD45、CD44、CD34、CD24的表达。脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞各自分为诱导组、无因子诱导组和对照组，诱导组以转化生长因子β1标准软骨诱导液培养，无因子诱导组以不含转化生长因子β1的软骨诱导液培养，对照组以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。培养14 d后用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果与结论：两种细胞CD105、CD90、CD29表达阳性，CD45、CD44、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14 d后两种细胞诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因表达水平较对照组均明显升高，差异有显著性意义(P <0.05)；髓核间充质干细胞诱导组3种基因的表达水平明显高于脂肪间充质干细胞诱导组，差异有显著性意义(P <0.05)。提示脂肪间充质干细胞与髓核间充质干细胞均具有向类髓核细胞分化的能力，而髓核间充质干细胞相对于脂肪间充质干细胞其软骨相关基因表达更高，可能更适合于作为组织工程髓核研究的种子细胞。
-
低浓度TNF-α对大鼠髓核间充质干细胞增殖及迁移的影响
[目的]探讨低浓度TNF-α对大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus derivedstem cells,NPSCs)增殖及迁移特性的影响.[方法]差速贴壁法从SD大鼠尾椎髓核组织中分离NPSCs,体外培养,镜下观察细胞形态和生长状况;取P3代细胞利用流式细胞仪鉴定干细胞表面抗原;使用诱导培养基进行三系诱导分化,3周后分别用茜素红、油红O、阿利辛蓝染色观察成脂、成骨、成软骨能力.用含不同浓度(0、0.1、1、10 ng/ml) TNF-α的血清培养液培养P3代细胞,0、1、3、5、7d后CCK-8法检测细胞增殖活力(OD值),划痕实验及Transwell迁移实验比较各组细胞迁移能力.[结果]P0代细胞呈集落样生长,细胞形态呈纺锤状.P3代细胞免疫表型鉴定MSCs表面分子标记CD90、CD29、CD44表达比例分别高达96％、99％、97％以上,低表达CD45、CD34(低于5％和4％).茜素红、油红O及阿利新蓝染色证实分离的细胞可向骨、脂肪及软骨分化.按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离的细胞即NPSCs.用含TNF-α培养液培养髓核间充质干细胞1、3、5、7d后,与对照组相比,低浓度的TNF-α均促进了NPSCs的增殖.Transwell及划痕实验表明随着TNF-α浓度的增加,NPSCs的迁移能力上升.[结论]低浓度的TNF-α(0.1～10 ng/ml)能促进NPSCs增殖及迁移能力.
-
接种密度对大鼠髓核间充质干细胞的影响
[目的]比较不同细胞接种密度传代培养大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells,NPMSCs)对NPMSCs的形态及表面标志物的影响.[方法]取12周龄SD大鼠椎间盘髓核组织体外消化获得原代细胞,待达到60％～70％融合时消化,并按接种密度分为三组,分别为低密度组(5个细胞/cm2)、中密度组(100个细胞/cm2、正常密度组(10 000个细胞/cm2).培养至达到传代条件后,各组细胞均按10 000个细胞/cm2在体外进行传代接种,进行形态学观察并检测干细胞的特征性表面标志(CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)的表达情况.[结果]在细胞形态学方面,各接种密度组细胞均可呈旋涡状贴壁生长,但低密废组以集落样生长,细胞多呈长梭形,形态一致;中密度组和高密度组细胞中类圆形、多边形细胞增多,大量细胞出现形态不规则、细胞宽大扁平、折光性差.在细胞表面标志物方面,低密度组CD44、CD90的表达率明显高于中密度组和高密度组(P＜0.05),而CD29、CD34、CD45差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]低密度接种法可提高大鼠NPMSCs CD44及CD90的阳性率,纯化NPMSCs.
-
正常与退变椎间盘来源髓核间充质干细胞的生物学性能比较
目的 比较SD大鼠正常与退变椎间盘来源髓核间充质干细胞(NPMSCs)的生物学性能.方法 获取正常(N-NPMSCs)及退变椎间盘来源NPMSCs(D-NPMSCs).流式细胞仪检测CD73、CD90、CD105、CD45及CD11b/c表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测性别决定区相关高迁移率族盒蛋白-2(Sox-2)、八聚体结合转录因子4(Oct-4)及Nanog干性基因表达.通过细胞形态、细胞克隆形成能力、细胞增殖及凋亡、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达活性,RT-PCR及Western blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、沉默信息调节蛋白1(SIRT1)及沉默信息调节蛋白6(SIRT6)的mRNA及蛋白表达,比较不同来源NPMSCs的生物学特性.结果 N-NPMSCs及D-NPMSCs均高表达干细胞相关阳性表面抗原分子,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子,但D-NPMSCs中干性基因表达(Sox-2:1.52 ±0.21,Nanog:2.15±0.16,Oct-4:1.73±0.11)较N-NPMSCs干性基因表达(Sox-2:3.41±0.94,Nanog:4.72±1.12,Oct-4:3.22±1.03)明显下降(t=6.145、6.556、7.806,P=0.000、0.000、0.000).两组细胞在形态学上差异无统计学意义,但D-NPMSCs细胞克隆形成率[(23.5±10.1)％]较N-NPMSCs[(39.4±12.2)％]明显下降(t=5.304,P=0.001).D-NPMSCs增殖速度减慢,且细胞凋亡率(10.43％)及Caspase-3表达活性(0.77)较D-NPMSCs(4.69％及0.72)显著增加(t=7.689、2.743,P=0.000、0.016).D-NPMSCs中HIF-1α、GLUT-1、VEGF、SIRT1及SIRT6的mRNA及蛋白相对表达量(0.35±0.23、0.51±0.22;0.94±0.14、0.90±0.13;0.02±0.01、0.41±0.02;0.04 ±0.02、0.73±0.34及0.51±0.22、0.84±0.05)较N-NPMSCs(1.00±0.00、1.00±0.00)明显下降(t=6.486、5.015;2.271、2.572;4.921、6.275;7.898、6.754;7.016、7.956,P =0.000、0.001;0.044、0.023;0.001、0.000;0.000、0.000;0.000、0.000).结论 退变椎间盘中NPMSCs表现出增殖能力减弱、干细胞干性维持能力下降及细胞凋亡增加的生物学特性.HIF-1α介导的信号通路可能参与NPMSCs增殖的调控.
