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骨髓基质细胞移植在中枢神经系统疾病中的应用
骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)具有多潜能性,在一定条件下可向神经细胞方向分化,,研究表明外源性BMSC移植入脑内后可以存活,迁移,并表现神经细胞形态,表达其特异性标记物,这种潜能提示BMSC可以用于神经系统疾病的细胞治疗,达到损伤修复或功能重建的目的.
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体外谱系选择法诱导胚胎干细胞神经分化特性的研究
目的 研究体外谱系选择法诱导胚胎干细胞(ES)神经分化的特点,建立ES细胞体外神经分化的模型.方法 通过悬滴和悬浮培养、Nestin阳性筛选培养、神经样细胞增殖培养以及神经细胞分化培养的方法,建立体外诱导未分化的ES细胞分化为多巴胺能神经元模型;观察各神经分化及各阶段的ES细胞形态,并通过RT-PCR以及荧光免疫化学方法检测各分化阶段ES细胞神经特异表达基因和蛋白的表达特点;通过高效液相检测各阶段分化细胞分泌神经递质多巴胺的能力.结果 随着分化培养阶段的延长,分化的ES细胞中可见大量神经样细胞出现,分化末期可见清晰的神经元结构(包括突触);分化早期,仅有部分神经细胞特异基因和蛋白表达,且表达水平低,随着培养阶段延长,特异基因和蛋白均表达,且表达水平明显增加;神经递质多巴胺的水平在未分化和分化早期细胞中未检出,分化的中后期可检测出并呈现随分化时间延长而增加的趋势.结论 建立的体外谱系选择培养方法可诱导ES细胞分化获得具有多巴胺能神经元特性的细胞,可为神经发育毒性研究提供模型.
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小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索
目的 探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系.方法 首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs).然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs.通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果.结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Soxl+的NPCs；NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs.第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mashl、BLBP高表达.第8代NSCs免疫荧光染色显示90％以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性.结论 成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代.
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BDE-209/BPA暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10早期神经分化中印记基因表达的影响
目的 探讨十溴联苯醚(BDE-209)和双酚A(BPA)暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10体外早期神经分化中印记基因表达的影响.方法 利用添加小分子抑制剂的方法将FY-hES-10细胞系进行神经贴壁诱导,并在培养基中添加低剂量的BDE-209或/和BPA,每24 h换液1次,连续暴露11 d.收集诱导分化第11天的细胞检测nestin阳性率以及印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A和PEG10的表达水平.结果 BDE-209、BPA单独或联合暴露组nestin的阳性率明显低于对照组(P<0.05).印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A在BDE-209、BPA单独或联合暴露组表达均明显低于对照组,PEG10在BDE-2091 nmol/L和BDE-2091 nmol/L+BPA 1 nmol/L组表达明显低于对照组,而在BPA 1 nmol/L组中表达与对照组无明显区别.结论 低剂量BDE-209/BPA单独或联合暴露均有可能通过影响胚胎干细胞早期神经分化中印记基因表达从而产生神经发育毒性,BDE-209和BPA联合暴露可能加重神经发育毒性.
关键词： 十溴联苯醚(BDE-209) 双酚A(BPA) 人胚胎干细胞 神经分化 印记基因 -
P53和P21在PC12细胞分化中的作用
目的 探讨P53及其下游P21蛋白在PC12细胞分化中的可能作用机制.方法 用反转录病毒质粒pBabe-P53/m175转染未分化PC12细胞,经筛选后建立野生型P53蛋白功能丧失的细胞系PC12(P53/m175);利用倒置相差显微镜、流式细胞术及Western blot等方法,比较两种细胞在神经生长因子(NGF)作用后,细胞分化表型、细胞周期及相关蛋白表达的改变.结果 NGF作用于正常PC12细胞组,P53/P21蛋白表达持续升高,细胞G1期阻滞出现的时间与蛋白表达开始增加的时间相一致;而在NGF作用的PC12(P53/m175)细胞组,细胞不能表达P21蛋白,且细胞周期G1期阻滞的程度也出现显著下降.NGF作用下,两组细胞都能观察到神经突起的生长,表现出明显的分化表型.结论 PC12细胞经NGF作用后出现P53及P21蛋白持续表达增加,主要介导了细胞分化过程中细胞周期G1期阻滞这一特征的出现,但并不是导致神经突起进行性生长这一特征的必需条件.
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食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化
目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础.方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞.在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果.结果 食蟹猴胚胎干细胞在饲养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性.诱导向神经细胞分化约14 d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21 d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35 d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少.结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞.
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优化建立猪多能性细胞及向神经谱系细胞特异性分化
目的 探讨建立猪多能性细胞(iPPCs)的优化方案,并探求其向神经谱系细胞特异性分化的方法.方法 利用经典的Yamanaka方法,联合应用组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)、甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-AZA)及Oct4病毒的重复感染,优化重编程方案,诱导巴马小型猪胚胎成纤维细胞为诱导的iPPCs.通过Real-time PCR检测重编程过程中多能性基因的分子表达.通过维甲酸(RA)及细胞外基质(ECM)的联合培养,诱导iPPCs向神经谱系细胞特异性分化,免疫荧光细胞化学方法检测神经特异性标记物表达.结果 应用优化方案,将猪胚胎成纤维细胞重编程为iPPCs.Real-time PCR显示,VPA和Oct4病毒的重复感染可显著促进重编程过程中多潜能基因的表达.5-AZA未显著提高多潜能基因的表达.RA及ECM的联合培养可诱导iPPCs向神经谱系细胞分化,并表达神经特异性标志基因神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 在利用优化方案建立猪多能性细胞的基础上,将其向神经谱系细胞特异性分化,对人类神经性疾病的细胞替代治疗具有重要意义.
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RT-PCR法检测神经源性分化因子mRNA在大鼠脑发育过程中的表达
目的 观察大鼠不同发育时期脑内神经源性分化因子(NeuroD) mRNA表达量的变化,探讨其对神经细胞的分化和成熟发挥的作用.方法 提取不同发育阶段大鼠不同脑组织中的mRNA,RT-PCR法反转录扩增NeuroD和β-actin,利用凝胶成像系统检测其相对表达量.结果 NeuroD在受孕7.5d(E7.5)时出现表达,在E10.5和E21.5时分别达到两次高峰,平均吸光度值为20437.88±598.28和14482.23±1134.49,表达水平显著高于其他各组(P＜0.01),NeuroD/β-actin比值在E12.5、E18.5和E21.5分别为1.59±0.09、1.61±0.07和1.70±0.11,显著高于其他时间段(P＜0.01).结论 在大鼠脑发育过程中,NeuroD mRNA的表达呈明显时间特异性,在E10.5左右大鼠各原始脑泡的形成过程中,NeuroD mRNA明显增高;在胚胎发育的晚期,脑组织形态进一步完善和成熟的过程中NeuroD达到第二次表达高峰,与鼠脑的发育过程相符.推测NeuroD对鼠脑的早期神经细胞分化以及晚期细胞的成熟均起一定作用.
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危重病多发性神经病患者诱导性多能干细胞系的建立及向神经细胞的诱导分化
目的 利用危重病多发性神经病(CIP)患者皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)系,并诱导其分化为神经细胞,为研究CIP神经细胞损害机制及治疗筛选提供细胞模型基础.方法 选取临床诊断明确的CIP患者,收集患者皮肤组织,分离出皮肤成纤维细胞,对所得细胞进行原代培养,采用Millipore慢病毒转染试剂盒,将含有Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc四个基因组合的慢病毒载体转染CIP患者皮肤成纤维细胞,诱导出患者来源的iPS.并采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、实时定量逆转录PCR、畸胎瘤成瘤等实验对诱导的iPS进行全能性鉴定,通过抑制SMAD信号通路诱导iPS分化为神经细胞.结果 培养的iPS镜下观察表现为人胚胎干细胞样克隆形态生长,碱性磷酸酶染色阳性,iPS细胞系的内源多能基因Sox2、REX1、NANOG和OCT4基因相对表达水平远远高于它们在初始的成纤维细胞中的表达水平(t值分别为-9.020、-10.753、-13.295、-12.677,P＜0.01),且iPS高表达人胚胎干细胞标志性蛋白,移植到免疫缺陷型小鼠模型体内能够形成畸胎瘤,并具有向三胚层分化的特点,验证本实验建立的iPS具有全能性,并可成功诱导分化为胆碱能神经元.结论 成功建立了CIP患者iPS细胞系,该iPS细胞系可成功分化为胆碱能神经元,可为CIP的发病机制研究和临床治疗探索提供良好的细胞模型.
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Mash-1转染对胚胎干细胞在小鼠脊髓损伤部位向神经细胞分化的促进作用
目的：观察过表达Mash-1基因的胚胎干细胞在脊髓损伤部位向神经细胞分化的情况及其对脊髓神经损伤的修复作用。方法采用鼠干细胞病毒将Mash-1基因转染CE3小鼠胚胎干细胞稳转株。4周龄雄性SPF级昆明小鼠钳夹法建立急性脊髓损伤模型。造模后3 d向脊髓损伤部位注射生理盐水(模型组, n=12)、CE3胚胎干细胞(CE3组, n=12)、转染Mash-1基因的CE3小鼠胚胎干细胞(CE3-Mash-1组, n=12)。术后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d检测小鼠后肢功能评分。术后14 d、28 d分别处死小鼠，HE染色观察脊髓剩余面积；CE3组、CE3-Mash-1组行Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ、神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色，观察移植细胞的分化。结果与模型组比较，移植CE3和CE3-Mash-1细胞的小鼠运动功能均提高(F>84.471, P<0.05)，脊髓剩余面积增加(F>49.990, P<0.05)。与移植CE3细胞相比，移植CE3-Mash-1细胞在损伤的脊髓部位Oct3/4阳性细胞数显著减少(t=5.439, P<0.001)，而nestin (t=-7.536, P<0.001)和β-tubulinⅢ(t=-9.941, P<0.001)阳性细胞数显著增加，GFAP阳性细胞数无显著性差异(t=1.701, P=0.120)。结论过表达Mash-1基因可促进CE3细胞在脊髓损伤部位分化成神经元，促进小鼠后肢运动功能的恢复。
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碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞向神经元分化并形成突触的研究
目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-壳聚糖载体对神经干细胞(NSCs)的诱导分化作用。方法原代培养新生24 h Wistar大鼠脊髓NSCs，纯化后分别向培养基加入单纯壳聚糖、单纯bFGF和bFGF-壳聚糖载体。3 d后，行Nestin和β-微管蛋白Ⅲ免疫荧光染色；7 d后，行微管相关蛋白2(MAP2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色；14 d后，行synapsin-1和MAP2免疫荧光染色，并利用MED64平面微电极阵列记录系统检测分化后神经元的电生理活性。结果培养3 d后，各组均可见Nestin+/β-微管蛋白Ⅲ+细胞，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞神经丝长度大于其他两组；7 d后，各组均可见MAP2+、GFAP+和MBP+细胞，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞MAP2+比例高于其他两组；14 d后，bFGF-壳聚糖载体诱导的细胞呈synapsin-1+/MAP2+，且有自发放电现象。结论 bFGF-壳聚糖载体诱导NSCs高比例向神经元分化，且分化而成的神经元之间形成突触，并具有电生理活性。
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两种体系下诱导多潜能干细胞定向分化为运动神经元前体细胞的差异
目的 将人诱导多潜能干细胞(iPSCs)定向分化为脊髓运动神经元前体细胞(MNP),并比较在有无饲养层两种体系下的分化效率.方法 分别在鼠胚胎成纤维细胞饲养层和无饲养层体系中培养人iPSCs.诱导6 d获得神经上皮前体细胞(NEP),诱导12 d获得MNP细胞.倒置显微镜下观察细胞形态变化,免疫荧光染色鉴定iPSCs、NEP、MNP标记物,实时定量聚合酶链反应检测NEP相关基因SOX1、HOXA3,MNP相关基因OLIG2、PAX6,及多能性基因SOX2、OCT4的转录水平.结果 两种体系中iPSCs均表达多能性标记物,NEP及MNP均高表达神经相关标记物,低表达多能性标记物,有饲养层体系中NEP细胞SOX1、HOXA3,MNP细胞OLIG2、OCT4基因表达明显高于无饲养层,PAX6和SOX2表达无显著性差异.结论 iPSCs在两种培养体系均可有效分化为MNP细胞,在有饲养层体系中分化效率较高.
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壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子载体诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化
目的探索壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)载体对骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用.方法免疫组织化学、Western blot检测MSCs诱导分化为神经细胞,MTT检测诱导后细胞的活性.结果 MSCs经壳聚糖-bFGF载体诱导后,表达神经干细胞的标记物Nestin以及神经细胞的标记物β-tubulinⅢ和MAP-2,比例高达83.54%.结论壳聚糖-bF-GF载体可以诱导MSCs高比例向神经细胞分化.
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骨髓间充质干细胞细胞周期同步化的方法及对向神经细胞分化的影响
目的：分析不同处理条件下细胞同步化于G0/G1时期的效果以得到佳的同步化条件，并研究同步化对骨髓间充质干细胞(BMSCs)在碱性成纤维细胞因子(bFGF)的作用下分化为神经细胞的影响。方法分离培养成年大鼠BMSCs，5%、1%、0.5%、0.1%、0胎牛血清(FBS)分别处理24 h、48 h。PI染色后经流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞所占比例，与正常培养条件(10%FBS)处理下对比。得到佳处理条件后，bFGF处理3 d、7 d，免疫荧光细胞化学方法检测Nestin和Tuj-1的表达。结果成年大鼠BMSCs原代提取，经传代后，细胞形态为长梭形。不同处理条件下G1/G0期细胞比例均高于正常培养条件，1%FBS处理48 h时G1/G0期细胞比例为(94.274±0.468)%，达高峰(F=39.91, P<0.001)。bFGF诱导3 d后，细胞周期同步化后的Nestin+细胞数显著高于未同步化的细胞数[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25, P<0.001)；bFGF诱导7 d后，同步化后的Tuj-1+细胞数显著高于未同步化的细胞数[(74.8±3.2)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95, P<0.001)。结论1%FBS处理48 h是将BMSCs同步化于G0/G1期的佳条件。细胞周期同步化于G0/G1期能够提高BMSCs向神经细胞分化的比例。
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同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定
目的:探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外的共培养方法,并行神经分化诱导.方法:分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后.取等量细胞混合后共培养,共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导,并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定.结果:共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态.经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞.结论:同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞.
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促进诱导多能干细胞向神经系统细胞分化的研究现状
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iiPSC)是一种应用相关转录因子将细胞重编程、逆转其发育潜能而得到的类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)的一种多能性干细胞.2006年,Takahashi与Yamanaka[1]将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc 4种因子转移至小鼠成纤维细胞,首次获得iPSC.由于其来源于自身细胞,自体移植时不涉及伦理问题,无免疫原性,在替代治疗、药物筛选、疾病建模等方面均可以发挥潜在的巨大优势[2].iPSC作为一种多能干细胞,在适当条件下可实现神经分化,即定向分化为神经干细胞(neural stem cell,NSC)、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等组成神经系统的各种细胞[3,4],因而成为治疗神经系统疾病的理想选择.有学者总结了经典的胚胎干细胞神经分化的方法[5-7],这也成为确立iPSC神经分化方法的重要参考.
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骨髓基质细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时间窗探讨
近年来,用干细胞移植治疗新生动物缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)取得了一定的效果[1].如何充分利用脑损伤内在的修复机制,使移植达到佳效果,目前关于这方面的研究较少,而且也主要基于成年动物大脑中动脉缺血(MCAO)模型.本研究在新生大鼠脑损伤后24 h、72 h、7 d进行移植,观察不同时间点移植对大鼠远期行为学影响、组织学改变以及BMSCs在脑内的神经分化,探讨新生大鼠HIBD后适宜的移植时间窗,为BMSCs临床移植治疗提供理论基础.
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色素上皮源性因子和眼内新生血管性病变
色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一种可溶性糖蛋白，具有神经保护、促进胚胎神经分化、抑制视网膜、脉络膜新生血管等作用。越来越多的证据表明，PEDF在生理性和病理性的眼内新生血管生成过程中起着关键性作用，对PEDF的研究在基础、临床取得了突破性进展。PEDF的发现和认识以及PEDF与眼内新生血管性病变关系的阐明对于人眼新生血管的基础和临床研究具有重要意义。
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黄芪注射液对人牙髓干细胞神经分化的影响
目的 探讨黄芪注射液对人牙髓干细胞神经分化功能的影响.方法 采用不同浓度的黄芪注射液和神经诱导培养基诱导人牙髓干细胞分化为神经元样细胞.从细胞形态、Real-Time PCR和Western blot蛋白印记检测神经元标记蛋白巢蛋白、早期神经元标记蛋白微管蛋白和神经元特异性烯醇化酶等的表达.结果 加入黄芪注射液诱导后人牙髓干细胞胞体收缩,伸出细长凸起,形似神经元;Real-Time PCR和Western blot结果显示黄芪注射液可促进巢蛋白、微管蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达.诱导效果与药物浓度有关.黄芪注射液浓度200和100μl/mL效果佳.结论 200和100μl/mL黄芪注射液可促进人牙髓干细胞神经分化能力.
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丹参促进人脱落乳牙牙髓干细胞神经分化的研究
目的 探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)神经分化功能的影响.方法 利用不同浓度的丹参注射液和神经诱导培养基诱导SHED分化为神经元样细胞.通过观察SHED经诱导后细胞的形态变化和采用Real-Time PCR方法检测神经元标记蛋白Nestin、早期神经元标记蛋白Ⅲ-Tubulin、神经细胞粘附因子NCAM、神经分化因子NeuroD、辅助T淋巴细胞因子TH、NEF等的表达,来鉴定神经元样细胞.结果 丹参注射液诱导后SHED胞体收缩,突起伸出,形似神经元;Real-TimePCR结果显示丹参注射液促进神经元标记蛋白Nestin、早期神经元标记蛋白Ⅲ-Tubulin、神经细胞粘附因子NCAM、神经分化因子NeuroD、NEF的表达.丹参注射液联合神经培养基诱导SHED神经分化的佳丹参注射液浓度为50mg/ml.结论 中药丹参在一定浓度范围内可促进SHED向神经元样细胞分化.
