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  • 冷冻技术对精子印记基因DNA甲基化影响的研究

    作者:杨向祎;郭颖;曹小芳;贾艳飞;王晓尉;许剑锋;周芳;李鸿;梁小薇

    目的 检测常规精液冷冻技术中冷冻保护剂、冷冻过程及冷冻时间长短对精子父源印记基因H19及母源印记基因MEST印记控制区域(imprinting control region,ICR)的DNA甲基化的影响程度. 方法 以10例符合精子库捐精条件的正式志愿者为研究对象,将每份精液样品平均分为4组:A组为新鲜精液,作为对照;B组加入同体积冷冻保护剂,不冷冻;C组加同体积冷冻保护剂,冷冻2d;D组加同等体积冷冻保护剂,冷冻两个月.通过亚硫酸氢盐克隆测序法分析H19及MEST ICR的DNA甲基化状态. 结果 四组(A、B、C、D组)H19基因ICR区的DNA甲基化率以克隆数计算时分别为58.70%、53.85%、49.46%和45.74%,以CpG岛数计算时分别为97.57%、97.33%、97.13%和96.56%,两者都有降低趋势,但组间差异均无统计学意义(P>0.05);四组MEST基因ICR区甲基化率以克隆数计算时分别为41.10%、45.33%、47.30%和50.68%,以CpG岛数计算甲基化率时分别为1.77%、1.74%、2.00%和2.26%,有升高趋势,但差异亦无统计学意义(P>0.05). 结论 常规精液冷冻复苏技术对精子父源印记基因H19及母源印记基因MEST的ICR区甲基化程度未见明显影响.

  • BDE-209/BPA暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10早期神经分化中印记基因表达的影响

    作者:杜丽丽;李晓梅;李秀英;唐境蔓;陈兢思;陈敦金

    目的 探讨十溴联苯醚(BDE-209)和双酚A(BPA)暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10体外早期神经分化中印记基因表达的影响.方法 利用添加小分子抑制剂的方法将FY-hES-10细胞系进行神经贴壁诱导,并在培养基中添加低剂量的BDE-209或/和BPA,每24 h换液1次,连续暴露11 d.收集诱导分化第11天的细胞检测nestin阳性率以及印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A和PEG10的表达水平.结果 BDE-209、BPA单独或联合暴露组nestin的阳性率明显低于对照组(P<0.05).印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A在BDE-209、BPA单独或联合暴露组表达均明显低于对照组,PEG10在BDE-2091 nmol/L和BDE-2091 nmol/L+BPA 1 nmol/L组表达明显低于对照组,而在BPA 1 nmol/L组中表达与对照组无明显区别.结论 低剂量BDE-209/BPA单独或联合暴露均有可能通过影响胚胎干细胞早期神经分化中印记基因表达从而产生神经发育毒性,BDE-209和BPA联合暴露可能加重神经发育毒性.

  • 孤雌胚胎干细胞来源的诱导多能干细胞的建立及对印记基因表达的影响

    作者:单智焱;武玢;张玥;薛媛;吴嫣爽;沈星辉;雷蕾;刘忠华

    目的 通过诱导多能干细胞(iPSCs)技术重编程孤雌胚胎干细胞,探讨iPSCs技术对孤雌胚胎干细胞的多能性及印记基因的影响.方法 从孤雌激活的囊胚中建立了孤雌胚胎干细胞;利用反转录病毒将多能性转录因子转入孤雌胚胎干细胞中,建立孤雌iPS细胞.结果 建立的孤雌来源的iPS细胞体内外分化能力与孤雌胚胎干细胞的差别无显著性;Real-time PCR结果显示,孤雌iPS细胞母源印记基因的表达明显高于孤雌胚胎干细胞,父源印记基因表达下降,多能性基因表达升高.结论 iPSCs技术能影响基因的表达,尤其是印记基因,印记使其更接近于正常受精来源的胚胎干细胞中印记基因水平.

  • 小鼠胚胎生殖细胞系的建立及其印记状态

    作者:胡静;赵巧湜;古艳丽;白光宇;吴稀;雷蕾

    目的 成功建立小鼠胚胎生殖细胞(EGCs)系,并初步分析小鼠胚胎生殖细胞的印记状态.方法 建立交配后12.5d(12.5dpc)原始生殖细胞(PGCs)来源的小鼠EGCs,通过碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫荧光细胞化学、体内分化及体外分化等方法检测EGCs的多能性,并以小鼠胚胎干细胞(ESCs)为对照,应用Real-time PCR检测EGCs中与发育相关的Ins2、Lgf2、H19、Lgf2r等11个父源与母源印记基因的表达情况.结果 成功建立小鼠EG细胞系,EGCs克隆AKP染色显示有高水平的AKP活性,免疫荧光细胞化学方法显示克隆表达小鼠ESCs多能性标记物Oct4及细胞表面标记SSEA-1.核型分析检测显示,小鼠EGCs为正常的40条染色体,体内可分化出3个胚层来源的组织,说明小鼠EGCs具有多能性;Real-time PCR结果显示EGCs的印记基因表达量显著高于ESCs.结论 12.5dpc PGC来源的EGCs的印记基因处于擦除状态.

  • 小鼠孤雌胚胎及孤雌胚胎干细胞中印记基因的表达

    作者:宋司航;张梓卉;廖辰;雷蕾

    小鼠孤雌胚胎体内发育多不能超过10.5d,发育失败的主要原因是胚外组织发育缺陷和印记基因表达的异常.随着小鼠孤雌二倍体和单倍体胚胎干细胞的建系成功,不仅能作为研究印记基因的理想模型,还能够作为种子细胞应用于细胞治疗,拓宽了小鼠孤雌生殖的研究领域和再生医学应用范围.孤雌胚胎聚合作为一种简便易行的技术手段,能够显著提高孤雌胚胎干细胞的建系效率,还能促使异质胚胎间的印记基因相互补偿从而更加趋近于正常受精的胚胎干细胞.我们在文中主要阐释了小鼠孤雌胚胎、孤雌聚合胚胎、孤雌二倍体胚胎干细胞、孤雌单倍体胚胎、孤雌聚合胚胎干细胞中印记基因的表达.

  • 肝癌组织中遗传印记基因PEG10表达的特异性及其意义

    作者:常莹;陶璐薇;陈孝平;周秀敏;宋宇虎;黄锦;张琼;林菊生

    目的:研究PEG10在肝癌组织中表达的特异性,为其作为一个潜在的肝癌基因治疗的新的分子靶点提供实验依据.方法:从来自不同器官组织的肿瘤细胞系(人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株SGC7901、人结肠癌细胞株Lovo、人胰腺癌细胞株PC3、人黑色素瘤细胞株A375、人T淋巴瘤细胞株Jurkat)、正常人胎肝细胞株L02、32例肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织、10例良性肝病患者肝组织、10例正常人外周血单个核细胞中抽提总RNA,经RT逆转录合成cDNA,再以PCR方法检测PEG10的表达.同时,肝癌组织和癌旁组织标本经RT-PCR检测AFP的表达.结果:经RT-PCR扩增的PEG10基因片段为455 bp,AFP基因的扩增片段为140 bp,与原设计一致;PEG10 在人肝癌细胞株HepG2中明显表达,人胃癌细胞株SGK7901、人结肠癌细胞株Lovo、人胰腺癌细胞株PC3中弱表达,而正常人胚胎肝细胞株LO2和其他肿瘤细胞株(人T淋巴细胞瘤、人黑色素瘤)中表达均为阴性.在32例肝癌及相应癌旁组织中,PEG10的表达阳性率分别为78.1%和0%;而AFP基因的阳性率分别为93.8%和59.4%.经McNemar检验,显示PEG10基因在肝癌组织中表达的敏感性与AFP表达敏感性之间无显著性差异(x20.01,1=1.78,P>0.05);而癌旁组织中PEG10表达率(0/32)明显低于AFP表达率(19/32)(x20.001,1=17.05,P<0.01).另外10例良性肝病患者(肝硬化4例,自身免疫性肝病2例,肝血管瘤2例,丙型肝炎1例,血色素病1例)肝组织标本及正常人的外周血细胞进行PEG10基因检测,结果均为阴性.结论:PEG10的表达不但具有比AFP更高的肝癌组织特异性,而且具有相对器官组织特异性.本实验为PEG10作为一个新的肝癌标志物和基因治疗的分子靶点提供了实验依据.

  • 肿瘤中胰岛素样生长因子Ⅱ基因印记及其丢失的机制

    作者:樊红;徐卫芳

    基因组印记(genomic imprinting)是目前肿瘤医学领域研究的新热点,印记基因胰岛素样生长因子Ⅱ基因(insulin-like growth factor 2,IGF2)与肿瘤相关性的研究也逐渐显现其参与肿瘤的发生、发展过程.IGF2是早发现的印记基因之一,对个体的生长发育起着重要的作用.近年发现大多数恶性肿瘤中都存在该基因的印记丢失所致的IGF2高表达现象,且IGF2印记丢失可以作为大肠癌等肿瘤发生危险性的分子标记,但肿瘤中IGF2印记形成和丢失的机制尚不清楚,本文将从等位基因差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)甲基化状态、绝缘蛋白CTCF(CCCTC-binding factor)结合能力及BORIS (brother of the regulator of imprinted sites)共同参与印记形成几个方面,阐述肿瘤中IGF2印记形成及其印记丢失的可能机制.

    关键词: 印记基因 DMR LOI CTCF
  • 遗传印记基因PEG10在子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

    作者:梁小妍;陈雄;陈夏

    目的 探讨遗传印记基因 PEG10在子痫前期(PE)患者胎盘组织中的表达及意义.方法 选取2010年8月至2012年6月在上海市第一人民医院宝山分院妇产科住院分娩的22例PE患者的临床病历资料为研究对象,并纳入研究组,选取同期在本院行择期剖宫产分娩的正常足月妊娠孕妇22例纳入对照组.2组受试者的年龄,孕龄,孕、产次等一般临床资料比较,差异无统计学意义(P>0.05).采用荧光实时定量逆转录聚合酶反应(RT FQ-PCR)及免疫组织化学方法检测2组受试者胎盘组织中PEG10 mRNA及蛋白的表达与分布(本研究遵循的程序符合上海市第一人民医院宝山分院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,分组征得受试对象的知情同意,并与之签署临床研究知情同意书).结果 PEG10 mRNA及蛋白在研究组和对照组胎盘组织中均有表达(0.5832±0.0450 vs.0.1943±0.0350,0.1258±0.0860 vs.0.0572±0.0050),2组比较,差异有统计学意义(t=6.8266,P<0.001;t=2.4296,P<0.01,P<0.05).结论 PEG10基因上调可能是早期PE表现的分子标志之一.

  • 印记基因IGF-2和H19的印记状态与异常出生体重的关系

    作者:付景丽;宋薇薇;李冬梅

    近年来异常出生体重的发病机制成为研究热点,而决定胎儿生长的关键因素是胎盘的发育及胎盘供应营养的能力.有证据表明印记基因对胎盘的生长及转运功能有调节作用,控制营养供给[1],对胎儿生长发育很重要,其中胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)及其交互印记基凼H19对胎儿生长发育[2]和胎盘形成及功能有重要调节作用.本研究旨在探讨印记基因IGF-2和H19的印记丢失(loss of imprinting,LOI)与异常出生体重的关系.

  • 印记基因H19和SNRPN CpG位点甲基化状态与精液参数的关联研究

    作者:彭红莉;胡海翔;王友信;沈传运;马春晓;张杰;赵飞飞;高晴;刘姣男;宋曼殳

    目的:分析印记基因H19和SNRPN印记控制区的各CpG位点甲基化状态与男性精液参数的关联.方法:选取2014年4至9月于空军总医院男科就诊的符合纳入排除标准的205例男性为研究对象,采用焦磷酸测序法定量分析H19和SNRPN基因的各CpG位点的甲基化状态,采用典型相关分析印记基因H19和SNRPN的各CpG位点的甲基化水平与精液参数两组变量的整体相关性.结果:H19基因的CpG2和CpG3甲基化水平与精子密度和精子活动力的相关性具统计学意义;SNRPN基因的CpG5、CpG6、CpG7甲基化水平与精子正常形态率的相关性具统计学意义.结论:印记基因H19和SNRPN印记控制区特定CpG位点甲基化状态与精液参数有关联.

  • 辐射对小鼠精子发生过程中印记基因表达的影响

    作者:朱斌;鹿亚超;陈颖;黄健;黄兴华;赵经涌

    目的筛选在小鼠精子发生过程中受电离辐射影响表达发生改变的印记基因.方法选择雄性BALB/c小鼠8只,分为实验组和对照组X射线全身照射0.1 Gy/d,连续13 d,建立辐射干扰小鼠精子发生模型.提取实验组和对照组睾丸RNA,采用上海生物芯片中心小鼠寡核苷酸基因表达谱芯片筛选表达发生改变的印记基因,对感兴趣的基因经半定量RT-PCR验证.结果12个表达发生改变的印记基因,6个上调,6个下调,其中Igf2、Peg3基因Ratio值分别为3.859和0.397,经半定量RT-PCR验证与芯片结果相符.结论X射线全身照射可导致小鼠睾丸部分印记基因表达发生改变.

  • 印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤细胞的放射增敏作用及机制研究

    作者:李懿;王运来;刘均;李继聪;陈宏

    目的 探讨印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤放射敏感性的影响及相关分子机制.方法 通过基因转染技术,将真核表达质粒pEGFP-C3-PHLDA2导入骨肉瘤U2OS细胞,经G418持续筛选获得稳定高表达PHLDA2蛋白的亚克隆细胞.实验分为3组:不转染的空白对照组,U2OS;稳定转染pEGFP-C3质粒的阴性对照组,U2OS-neo;pEGFP-C3-PHLDA2质粒的稳定转染组,U2OS-PHLDA2.采用CKK8比色法测定4和8 GyX射线照射后细胞的增殖活性;克隆形成实验观察0~8 Gy照射后细胞的存活能力;Annexin V/PI染色法检测8 Gy照射后的细胞凋亡;Western blot测定蛋白的表达变化.建立人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,观察10 Gy照射后PHLDA2基因的体内增敏效应.结果 经筛选获得的骨肉瘤亚克隆U2OS-PHLDA2细胞中PHLDA2蛋白表达上调(t=13.73,16.28,P<0.05).与U2OS和U2OS-neo组相比,PHLDA2高表达组在4和8 Gy的增殖能力明显降低(t=5.00 ~ 8.23,P<0.05),2~8 Gy的克隆形成能力明显降低(t=-2.52~-1.26,P<0.05);同时照后裸鼠移植瘤的生长抑制作用显著提高(=3.27、2.91,P<0.05).8 Gy照后,PHLDA2高表达组的凋亡率为(17.97±1.69)%,高于U2OS组的(6.47±1.01)%和U2OS-neo组的(7.15±0.96)%(t=10.11、9.61,P<0.05);同时Caspase-3活性明显提高(t=11.26、10.72,P<0.05).结论 外源性PHDLA2基因在U2OS细胞中稳定过表达能够提高骨肉瘤对X射线的敏感性,其机制可能是通过增强Caspase-3的活性、促进射线诱导的细胞凋亡作用实现的.

  • BDE-209暴露对人胚胎干细胞印记基因表达的影响

    作者:杜丽丽;匡丽云;陈敦金

    目的 探讨十溴联苯醚(BDE-209)暴露对人胚胎干细胞系(FY-hES-10细胞)印记基因表达的影响.方法 将FY-hES-10细胞分别暴露于含终浓度为0(溶剂对照,DMSO浓度为1%)、1、10、100 nmol/L BDE-209的培养基,每24 h换液1次,连续暴露96 h.测定Ki-67阳性率及母源性印记基因H19、KCNK9、DLX5、UBE3A和父源性印记基因SNRPN、MEST、PEG10、cLIS3的表达水平以及基因组DNA总体甲基化水平.结果 与溶剂对照组比较,各剂量BDE-209暴露组FY-hES-10细胞的Ki-67阳性率和基因组总体DNA甲基化水平均较低,差异有统计学意义(P<0.05);且随着BDE-209暴露剂量的升高,而FY-hES-10细胞的Ki-67阳性率呈下降趋势.各剂量BDE-209暴露组FY-hES-10细胞内H19、KCNK9、UBE3A、SNRPN、PEG10基因的表达水平均较低,而DLX5、GLIS3基因的表达水平均较高,差异有统计学意义(P<0.05);MEST基因的表达水平均无明显改变.且随着BDE-209暴露剂量的升高,FY-hES-10细胞H19、KCNK9、PEG10基因的表达水平均呈下降趋势,GLIS3基因的表达水平呈上升趋势.结论 BDE-209有可能通过影响印记基因的表达从而产生胚胎发育毒性.

  • PEG10在重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及临床价值

    作者:朱小丹;糜媛媛;许文娟;严晓;毕艳丽

    目的:探讨印记基因 PEG10在重度子痫前期(SPE)患者胎盘组织中的表达及临床价值。方法选取2013年4月至2015年3月分娩以及因故中止妊娠的145位孕母作为研究对象,按照孕周和孕期发作 SPE 情况将研究对象分为4组:早发 SPE 组33例,早期健康组35例,晚发 SPE 组37例,晚期健康组40例。采集孕母胎盘组织制成切片,免疫组化法进行附染并检视 PEG10蛋白表达情况,CMIAS 病理图像分析软件测定吸光度 A 并比较。结果PEG10蛋白在4组滋养层细胞膜和胞浆均有表达。早发 SPE 组 PEG10蛋白表达强度明显高出早期健康组,晚发 SPE组 PEG10蛋白表达强度远远超出晚期健康组( P <0.01);晚发 SPE 组表达值较早发 SPE 组小幅偏低,但差异无统计学意义(P >0.05)。结论胎盘组织中 PEG10的高水平表达可能与 SPE 的发病有关。

  • 辅助生殖技术与印记基因疾病的研究进展

    作者:艾初初;施晓鋆

    辅助生殖技术(ART)是目前解决不孕不育的主要方式,目前已有超过600万儿童通过辅助生殖技术出生[1],随着ART出生儿的逐渐增多,与这项医疗有关的遗传安全问题也越来越引起人们的重视.有研究发现通过ART出生儿中印记基因异常的疾病增加,可能与ART导致了印记基因的改变有关.本文就辅助生殖技术与印记基因疾病的关联性进行表述.

  • 印记基因H19和IGF-Ⅱ mRNA在新生儿胎盘中的表达与出生体质量的关系

    作者:刘小霄;宋薇薇

    目的 研究新生儿胎盘中印记基因H19和胰岛素样生长因子Ⅱ基因(W,F-Ⅱ gene)mRNA的表达,探讨印记基因H19和IGF-Ⅱ与出生体质量的关系.方法 收集无妊娠期并发症及无胎盘脐带异常的足月儿新鲜胎盘共30例,其中正常出生体质量儿12例、巨大儿10例,足月小样儿8例,采用实时荧光定量PCR方法检测以上标本中H19和IGF-Ⅱ mRNA表达.结果 H19基因在胎盘中表达与出生体质量呈负相关(r=-0.403,P=0.027),IGF-Ⅱ基因在胎盘中表达与出生体质量呈正相关(r=0.444,P=0.014);巨大儿组胎盘中H19 mRNA表达(0.21±0.31)较足月小样儿组(1.51±2.04)明显减少(P=013);巨大儿组胎盘中IGF-Ⅱ mRNA表达(2.67±3.41)较足月小样儿组(0.39±0.33)明显增加(P=0.013).结论 印记基因H19与IGF-Ⅱ的表达在不同出生体质量儿胎盘中差别明显,两基因与出生体质量的影响机制相关,且两基因之间存在一定相互关系.

  • 过期流产组织中胰岛素样生长因子-2与H19印记基因的表达

    作者:程露平;洪慧莉;孙睿;杨燕;毕小霞;张敏

    目的 探讨胚胎绒毛组织中胰岛素样生长因子-2(IGF-Ⅱ)和H19印记基因表达与过期流产的关系.方法 应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术测定正常早孕女性38例(对照组)和41例过期流产患者(实验组)胚胎绒毛组织中IGF-Ⅱ和H19印记基因的表达水平,并进行对比分析.结果 实验组胚胎绒毛组织中IGF-ⅡmRNA的表达显著低于对照组(t=8.662,P<0.05);H19 mRNA的表达显著高于对照组(t=12.706,P<0.05).结论 胚胎绒毛组织中IGF-Ⅱ、H19印记基因的异常表达可影响胚胎的正常发育,可能是导致过期流产发生的原因之一,可为过期流产的基因诊断提供新的切入点.

  • 胰岛素生长因子Ⅱ在肾癌中的印记状态及其意义

    作者:肖露;冷慧敏;王勇;周亮

    目的 探讨肾癌组织中胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的印记丢失状态及意义.方法 应用限制性内切酶切片段长度多态性分析法,检测印记基因IGF-Ⅱ在75例肾癌患者的癌组织及其癌旁组织中的印记状态.结果 在75例肾癌标本中,癌及癌旁组织IGF-Ⅱ均为杂合子基因型的58例(77.3%).其中有26(44.8%)例癌及癌旁组织均发生IGF-Ⅱ印记丢失(LOI);5(8.62%)例癌组织发生IGF-Ⅱ LOI而癌旁组织IGF-Ⅱ印记正常;1(1.72%)例癌旁组织发生IGF-Ⅱ LOI而癌组织为正常印记状态.在14岁到72岁的各年龄段男性和女性来源组织标本中均存在癌及癌旁组织IGF-Ⅱ LOI的发生,且频率相近,没有统计学差异.在58例杂合子组织标本中,分别有31(53.4%)例癌组织、27(46.6%)例癌旁组织发生IGF-Ⅱ LOI.统计分析结果表明肾癌癌组织IGF-Ⅱ LOI发生率与癌旁组织IGF-Ⅱ LOI发生率没有统计学差异.结论 肾癌癌组织及癌旁组织IGF-Ⅱ LOI 的发生与性别及年龄无显著相关,肾癌中癌旁组织IGF-Ⅱ LOI的发生率与癌组织接近,可能是疾病发生早期事件.

  • DNA甲基化与印记基因

    作者:王宁;金帆;黄荷凤

    表遗传指不影响DNA遗传编码而调控基因组活性的过程,甲基化转移酶在该过程中发挥着重要的作用.配子的表遗传编程是印记建立的必要条件,与印记的形成机制有关,对基因组功能有重要影响.DNA甲基化、组蛋白乙酰化在印记基因表达过程中相互作用.印记基因可以解释肿瘤的发生以及一些遗传性疾病.有逐渐增多的证据表明,辅助生殖技术(assisted reproductive technologies,ART)与印记基因存在联系,探索ART影响印记基因的机制将有助于ART技术的完善,防止ART相关并发症的发生.现就DNA甲基化与印记基因研究进展作一综述.

  • 印记基因对胚胎发育的影响

    作者:李雅琼;黄燕芳;杨晓煜

    在哺乳动物中,有一部分特别的基因,它们由于受到印记而只表达单一亲本的基因,这种表遗传的修饰现象就是基因组印记,这与经典孟德尔遗传学定律不同,有许多的印记基因,在一亲本表达,而在另一亲本沉默.基因印记属于表遗传修饰范畴,DNA甲基化是一种重要的表遗传修饰,主要的修饰部位发生在DNA的CpG岛,它参与了细胞的分化,基因组的稳定等多种细胞生物学过程.在胚胎的发生、发展过程中印记基因的作用贯穿始终.基因组印记经历了一系列的擦除、重建与维持过程,为胚胎的发生、发展奠定了基础,基因印记对原始生殖细胞核的全能性、配子的成熟、胚胎的生长发育、胎盘的结构和功能,以及出生后个体的生长发育均有重要意义.印记基因的异常,将会对胚胎的发生以及发育产生深远的影响.该文基于国内外对印记基因的研究,结合新的一些研究进展,就印记基因对胚胎发育的影响作了一系列综述.

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