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聚乙二醇交联去细胞瓣构建组织工程瓣膜复合支架
目的 采用分子量20 kDa 的枝化状丙烯酰化聚乙二醇(PEG)交联巯基化去细胞瓣,构建组织工程瓣膜复合支架,并对支架的结构稳定性、力学性能和细胞相容性进行初步检测.方法 取猪新鲜主动脉瓣叶,进行脱细胞瓣处理,制备去细胞瓣并巯基化.戊二醛固定去细胞瓣,PEG 交联巯基化去细胞瓣.形态学观察去细胞及交联效果,差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度,Ⅰ型胶原酶溶液测定其抗酶性分解能力,拉伸实验测定其抗拉强度和弹性模量,并采用AlamarBlue 法测定支架对MRC-5 人胚肺细胞的细胞毒性.结果 HE 染色和扫描电镜(SEM)显示去细胞完全,细胞外基质保存完整;PEG 交联后瓣叶变薄,纤维增粗呈束.PEG 交联瓣的热收缩温度为(75.16 ±0.69)℃,与去细胞瓣[(67.63 ±1.09)℃]相比有显著提高,其差异有统计学意义(P ＜0.05).PEG 交联瓣6 h 及12 h酶性分解率分别为(17.52 ±1.69)%和(48.83 ±2.67)%,与去细胞瓣[(64.91 ±2.05)%和(98.23 ±1.20)%]相比,分解率显著下降.PEG 交联瓣抗拉强度较去细胞瓣显著为高,并达到天然瓣水平,弹性模量则远高于其他各组.细胞毒性试验显示PEG 组和对照组活力细胞差别为(1.82 ±0.03)%,无统计学意义(P ＞0.05).结论 PEG 交联可显著改善去细胞瓣结构稳定性和力学性能,而无明显细胞毒性,有望用于组织工程瓣膜复合支架的构建.
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血管内皮细胞生长因子修饰的聚乙二醇化去细胞瓣构建心脏瓣膜复合支架
目的 对去细胞瓣进行聚乙二醇(PEG)化改性和血管内皮细胞生长因子(VEGF)共价修饰,以改善去细胞瓣力学性能和生物学性能,并联合内皮祖细胞构建心脏瓣膜复合支架.方法 枝化状PEG末端的丙烯酰基与引入到去细胞瓣上的巯基,通过迈克尔加成反应完成去细胞瓣的PEG化,并作去细胞瓣PEG化前后以及天然主动脉瓣的生物力学测定;通过PEG化去细胞瓣上未饱和的丙烯酰基与VEGF巾半胱氨酸残基上的巯基发生另一个迈克尔加成反应,对去细胞瓣进行VEGF共价修饰,免疫荧光测定VEGF修饰效果;在VEGF修饰的PEG化去细胞瓣、去细胞瓣和PEG化去细胞瓣上种植内皮祖细胞(EPCs),培养10 d后行瓣膜上DNA含量测定、苏木素.伊红染色和扫描电镜.结果 力学测试显示:PEG化去细胞瓣的大抗张强度较单纯去细胞主动脉瓣明显提高(P<0.05),而与天然主动脉瓣相比无差异(P>0.05);免疫荧光检测显示:VEGF可有效地共价修饰PEG化去细胞瓣;与PEG化去细胞瓣和单纯去细胞瓣相比,VEGF修饰的PEG化去细胞瓣明显促进EPCs的增殖,并且可在瓣膜表面形成一层连续的单细胞层.结论 PEG化可明显改善去细胞瓣的力学性能,并且VEGF修饰PEG化去细胞瓣可促进支架上黏附细胞的增殖,有利于改善组织工程心脏瓣膜的构建.
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精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究
目的:研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建的影响.方法:酶+去污剂法制备去细胞瓣天然支架,应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP,使GRGDSPC肽与之稳定结合,然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV.实验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣,对照组则为未处理去细胞瓣.体外培养1周后取瓣叶,作苏木精-伊红(H-E)染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA表达.结果:与对照组比较,实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富,羟脯氨酸和DNA含量值增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强.结论:RGD肽表面修饰去细胞瓣,提高天然支架细胞黏附性,促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌,有利TEHV构建.
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RGD肽固定对组织工程心脏瓣膜构建的作用
目的探讨促黏附分子RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)固定去细胞瓣在组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建中的作用.方法酶+去污剂法制备去细胞瓣支架,在耦联剂Sulfo-LC-SPDP作用下甘-精-甘-天冬-丝-脯-半胱氨酸(GRGDSPC)肽与之化学结合,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV.体外培养2周后取出瓣叶,作HE染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸反映胶原含量,检测DNA反映细胞增殖,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA的表达.结果与对照组比较,经肽固定的实验组瓣膜细胞密集且组织致密,羟脯氨酸和DNA含量增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强.结论采用RGD肽表面修饰去细胞瓣,不仅可显著提高支架黏附性,而且可促进细胞生长和胶原分泌,有利于TEHV的构建.
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体外构建经血管内皮生长因子共价修饰去细胞瓣的研究
目的 基于迈克尔加成反应,体外构建经血管内皮生长因子(VEGF)共价修饰的去细胞猪主动脉瓣(DPAV)复合材料,探讨复合瓣膜的力学性能和生物学性能.方法 应用枝状化聚乙二醇(PEG)对去细胞的猪主动脉瓣PEG化,PEG化去细胞瓣(PEG-DPAV)与VEGF上的巯基发生反应,将VEGF共价修饰到去细胞瓣上(VEGF-PEG-DPAV).检测VEGF共价修饰去细胞瓣的效果;对复合瓣膜在周向和径向上力学性能进行测试;通过差示扫描量热仪(DSC)、溶血实验和细胞毒性实验测试复合瓣膜的生物学性能.结果 通过红外光谱和免疫荧光检测证实VEGF成功共价修饰到去细胞瓣上,苏木素-伊红(HE)染色和扫描电镜显示去细胞瓣膜交联PEG后,纤维增粗、排列整齐,结构更加致密.力学性能测试显示去细胞瓣PEG化后可以改善部分力学性能.DSC显示DPAV、PEG-DPAV和VEGF-PEG-DPAV组瓣膜的变性温度分别为(65.64 ±0.15)℃、(74.94±0.10)℃和(74.88 ±0.05)℃.溶血实验显示DPAV、PEG-DPAV和VEGF-PEG-DPAV组溶血率分别为(0.23±0.01)％、(0.24±0.01)％和(0.23±0.01)％.DPAV、PEG-DPAV和VEGF-PEG-DPAV组瓣膜均未表现出细胞毒性.结论 成功制备经VEGF修饰的PEG化去细胞瓣,为体外去细胞瓣的改性研究提供一种可行性方法.
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生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜
目的 去细胞瓣膜上种植人主动脉瓣膜间质细胞,生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜.方法 PEG交联去细胞瓣,GRGDSPC多肽共价修饰.RGD-PEG-去细胞瓣上种植人主动脉瓣膜间质细胞,缝制于生物反应器内.接种2、4、8h后,细胞计数观察细胞黏附情况.体外培养10d后行形态学观察和DNA含量测定.结果 免疫荧光检测显示,GRGDSPC多肽与PEG-去细胞瓣有效共价接枝.接种2、4、8h后,RGD-PEG-去细胞瓣组和单纯去细胞瓣组细胞计数分别为:(4.98±0.46)×107/L比(3.35 ±0.15)×107/L,(5.71 ±0.29)× 104 个/ml比(3.55±0.18)×107/L,(5.97±0.45)×107/L比(3.62±0.18) ×107/L,P＜0.05.RGD-PEG-去细胞瓣组较单纯去细胞瓣组DNA含量明显增高,(25.98±2.45)μg/瓣叶比(19.61±1.94)μg瓣叶,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 生物反应器内,GRGDSPC接枝的PEG-去细胞瓣复合支架,可促进种子细胞的黏附,改善瓣膜支架生物学性能.
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枝化状聚乙二醇交联去细胞瓣复合材料抗钙化性能研究
目的 探讨枝化状聚乙二醇(PEG)交联去细胞瓣复合材料的皮下抗钙化性能.方法 N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯(SATA)巯基化修饰去细胞瓣,以相对分子质量为20×103的枝化状丙烯酰化PEG交联获得复合材料(PEG组).以戊二醛固定天然瓣(GA-NAV组)和戊二醛固定去细胞瓣(GA-DAV组)为对照.取3组瓣膜样本各18枚,植入新西兰白兔背部皮下,分别于2、4、8周取出行Von Kossa染色观察钙沉积,原子吸收光谱法测定其钙含量.结果 GA-NAV组钙化发生快且进展迅速,2、4、8周的钙含量依次为(22.39±1.79)、(93.05±6.08)、(174.97±8.34) μg/mg,GA-DAV组钙化程度较轻,钙含量分别为(5.57±2.11)、(31.15 ±5.16)、(72.54±6.50) μg/mg,而PEG组未见明显钙化发生,对应钙含量仅为(0.46±0.07)、(1.68±0.10)、(2.92±0.25) μg/mg,相同时间点组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 相对分子质量为20×103的枝化状丙烯酰化PEG交联去细胞瓣复合材料具有良好的抗钙化性能.
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RGD肽对天然瓣膜支架细胞黏附性能的影响
精-甘-天冬氨酸(RGD肽)是公认有效的促黏附分子.我们采用化学交联法,使含RGD序列短肽与去细胞瓣共价键合,以直接混合短肽组与单纯去细胞瓣组作为对照,种植大鼠主动脉肌成纤维细胞.MTT试验显示RGD肽固定促进细胞黏附,且12 h内黏附率随时间和肽浓度递增.沉淀法计数和HE染色、扫描电镜检测证明类似结果.因此,RGD肽表面修饰天然瓣膜支架,提高细胞黏附性能,有利于组织工程心脏瓣膜的构建.
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环状RGDfK肽对肌成纤维细胞整合素αVβ3表达调控的实验研究
目的 探讨环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-脯氨酸-赖氨酸短肽(Cyclo-RGDfK)能否提高去细胞瓣对肌成纤维细胞(myofibroblast)的黏附性能,以及RGD肽对Integrin αVβ3基因表达的调控.方法 组织块培养法获取大鼠主动脉壁肌成纤维细胞(myofibroblast),免疫荧光染色检测波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分子在培养myofibroblast中的表达.将去细胞瓣随机分为3组(每组7个),A组:去细胞瓣未接受任何处理;B组:去细胞瓣与交联剂1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)反应36h;实验组:去细胞瓣与EDC反应36h后,再与Cyclo-RGDfK反应24h,使RGD肽共价结合于去细胞瓣.将第5代myofibroblast分别接种至各组瓣膜上.HE染色和扫描电子显微镜观察细胞黏附增殖状况,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Integrin αVβ3基因在各组的表达.结果 免疫荧光染色显示原代培养的myofibroblast生长良好,高表达Vimentin和α-SMA分子.HE染色和扫描电子显微镜显示myofibroblast在实验组的生长好于A组和B组,半定量PCR示Integrin αVβ3 mRNA在实验组的表达高于A组和B组,差异有统计学意义(P＜0.05),而A组与B组比较差异无统计学意义(P=0.900).结论 Cyclo-RGDfK促进myofibroblast在去细胞瓣上黏附,此效应可能与RGD肽上调Integrin αVβ3基因表达有关.
