环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中MMP-9表达的影响

目的 探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9;MMP-9)表达的影响.方法 采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,用3%环氧氯丙烷处理48h的去细胞支架材料作为实验组;用0.2%戊二醛处理48h的去细胞支架材料作为对照组.将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells;hBMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valves;TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,免疫组化检测MMP-9表达的阳性率.结果 hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-9的表达比对照组降低.结论 环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-9表达,对防止组织工程心脏瓣膜钙化的形成有一定作用.

血液流体动力学研究与生物反应器在组织工程化心脏瓣膜构建的应用

由于目前临床应用的心脏瓣膜替代物各有其固有的不足,探索以合适的方法构建具有生长活性的组织工程化心脏瓣膜一直是该领域各国学者研究报道的焦点.心脏瓣膜生物反应器模拟了心脏瓣膜在体内所处的血流动力学环境,并具有传质功能,所以在TEHV构建中除了要有足够健康的种子细胞和理想的生物支架材料,生物反应器是不可缺少的.对血液流动力研究进展,心脏瓣膜生物反应器的原理、构造与设计,生物反应器在心脏瓣膜组织工程中的应用范围进行了逐一概述.

胶原膜与聚-β-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜中应用的研究

目的：对胶原膜与聚-β-羟基丁酯在组织工程心脏瓣膜技术中的应用进行比较。方法：对照研究胶原膜和聚-β-羟基丁酯膜在材料结构、皮下包埋和细胞生长对照实验情况。结果：胶原膜呈网孔状结构，皮下包埋8周仍保持膜状结构，皮下包埋8～12周完全降解，生物相容性优于聚-β-羟基丁酯膜。结论：胶原膜在材料结构特征、降解率和生物组织相容性方面均优于聚-β-羟基丁酯，其适于组织工程心脏瓣膜种植材料的应用。

转化生长因子-β1对体外构建组织工程瓣膜的实验研究

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在组织工程心脏瓣膜(TEHV)体外构建中的作用.方法经胰酶/EDTA、去污剂Triton X-100和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV.实验组培养基中添加TGF-β1(10 ng/ml),对照组采用普通培养基.体外培养2周后取瓣叶,行HE染色和扫描电镜观察,并检测羟脯氨酸、DNA含量及瓣叶大负荷力,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜细胞MMP-13和TIMP-1 mRNA的表达.结果 HE染色和扫描电镜显示实验组较对照组的细胞联合紧密且细胞外基质更丰富,羟脯氨酸含量和DNA含量增高,大负荷力提高,MMP-13 mRNA和TIMP-1 mRNA的表达增强.结论 TGF-β1在TEHV体外构建过程中具有积极作用,能为种子细胞生长提供有利因素,促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高瓣膜的大负荷力.

人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建的组织工程心脏瓣膜

背景:去细胞处理的猪主动脉瓣膜植入人体后发生了免疫排斥反应,分析引起免疫排斥反应的原因是由于猪瓣膜的细胞外基质与宿主发生接触引起了免疫激活.目的:试图将人自身的细胞外基质履盖去细胞猪瓣膜表面起到隔离猪瓣膜与宿主血液成分接触的作用.同时应用免疫组化的方法验证人细胞外基质覆盖瓣膜的效果.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-08/2009-04在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室完成.材料:新鲜猪心脏瓣膜取白上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理.密度梯度离心法从健康志愿者骨髓中获取骨髓基质干细胞.方法:用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜,再应用前期制备的抗人细胞外基质单克隆抗体,采用免疫组织化学染色鉴定人细胞外基质在体外构建的组织工程瓣膜上的黏附情况.以未构建的去细胞猪瓣叶为对照组.主要观察指标:①组织工程瓣膜上种子细胞的黏附和生长情况.②免疫组织化学法检测人细胞外基质在瓣膜上覆盖的效果.结果:光镜下观察瓣膜表面均形成了细胞层.扫描电镜所见细胞排列欠规则,未完全覆盖去细胞瓣叶表面,可见裸露的瓣膜支架.免疫组织化学方法检测构建的瓣膜表面呈阳性反应证明有人的细胞外基质黏附,而对照组呈阴性证明了检测方法具有特异性.结论:体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质黏附.

脂肪间充质干细胞分化为内皮细胞并体外构建组织工程心脏瓣膜

背景:组织工程心脏瓣膜是利用组织工程技术将种子细胞种植于瓣膜支架上所构建的一种人工瓣膜,目前国内外研究主要集中于种子细胞来源及支架选择上.目的:探讨人脂肪间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后的细胞作为种子细胞,脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性.方法:利用吸脂术采集脂肪组织,分离、培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学方法及RT-PCR检测细胞分化标志物;应用Triton X-100 联合胰蛋白酶的方法制备脱细胞猪主动脉瓣支架,将体外培养扩增的诱导分化后的内皮细胞种植于支架上构建组织工程心脏瓣膜,光镜及电镜下观察组织工程心脏瓣膜的组织学结构.结果与结论:脂肪组织分离培养的脂肪间充质干细胞向内皮细胞诱导分化后表达CD31、CD34、CD144、Ⅷ因子和内皮型一氧化氮合成酶等内皮细胞特异性抗原;脱细胞猪主动脉瓣膜支架脱细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;构建的组织工程心脏瓣膜可见支架上排列连续的单细胞层.提示脂肪间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在脱细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建组织工程心脏瓣膜.

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景:现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷.组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向.目的:通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008 06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成.材事斗:用胰蛋白酶(胰酶)EDTA、Triton X-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质.从1只12 kg 2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞.方法:用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养.通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞.利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间尤质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线.以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察.将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3 d后进行扫捕电镜观察.主要观察指标:①试验犬伤口愈合情况.②细胞培养、增殖情况.③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察.结果:成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛,生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30 h,而成熟内皮细胞生长曲线平直.对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色.可见荧光染色阳性.扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附.结论:骨髓间充质下细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织上程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源.

层层静电自组装多聚电解质共混膜与组织工程心脏瓣膜细胞的黏附

背景:组织工程心脏瓣膜研究中的核心和难点是种子细胞在支架材料上的黏附.层层静电自组装技术能够将多聚阴阳离子组装成多层膜状结构增加材料表面的生物相容性.目的:拟对猪去细胞瓣膜在体外进行层层静电自组装成多聚电解质共混膜,并且检测共混膜列种子细胞黏附的效果.设计时间及地点:细胞学体外观察性实验,于2008-09/2009 02在解放军第二军医大学长海医院胸心外科实验室和复旦大学高分子科学系实验室完成.材料:新鲜猪心脏瓣膜取自上海五丰上食肉联厂,采用酶消化法将猪主动脉瓣叶行脱细胞处理.密度梯度离心法从骨髓中获取骨髓单个核细胞,体外扩增培养后鉴定.方法:通过层层静电自组装技术构建20,10,5,0层的壳聚糖,透明质酸共混膜履盖在猪去细胞瓣膜支架上.将骨髓基质干细胞在涂膜支架上种植培养并检测支架对种子细胞的黏附效果.主要观察指标:扫描电镜观察、细胞计数、MTT检测组织工程心脏瓣膜上种子细胞的形态和细胞黏附效果.结果:扫描电镜观察20层壳聚糖,透明质酸多层膜样品上细胞生长情况比较好,样品上可以铺满细胞.而在组装层数为5层和10层的样品上,细胞生长的比较少.构建层数为20层的瓣叶,其细胞计数及吸光值高于10层和5层构建的瓣叶(P<0.01).构建层数为10层和5层的瓣叶与0层比较差异无显著性意义(P>0.05).结论:通过层层静电自组装技术构建的共混膜能够促进种子细胞的黏附,而且有一定的量效关系.

中国组织工程心脏瓣膜研究领域——著名专家介绍

Galectin-8蛋白对组织工程心脏瓣膜种子细胞的增殖、黏附功能的影响

目的：体外研究Galectin-8在不同浓度或状态下对组织工程心脏瓣膜种子细胞增殖及黏附的影响。方法以骨髓间充质干细胞分化而来的内皮细胞作为种子细胞，离体状态下常规培养。采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定不同浓度下 Galectin-8作用12、24、48 h后对细胞增殖的影响；将细胞分为重组质粒pGFP-Galectin-8转染组、空质粒 pGFP转染组、阴性对照组及蛋白预铺组，分别铺于96孔板中，观察相同时间段的细胞黏附数量。结果 Galectin-810、20、40μg／ml剂量组的细胞增殖数目均显著高于空白对照组，其中20μg／ml组表现尤为显著（P＜0.05）；pGFP-Galectin-8转染组的转染效率与空质粒pGFP转染组无显著差异（P＞0.05），且 Galectin-8的表达量显著高于空质粒 pGFP转染组和阴性对照组（P＜0.05）；细胞种植到培养板上1、2、4 h后，蛋白预铺组相同时间的细胞黏附数量显著高于其他各组（P＜0.05），pGFP-Galectin-8转染组的细胞黏附数量显著小于其他各组（ P＜0.05），空质粒 pGFP转染组和阴性对照组的细胞黏附数量无显著差异（ P＞0.05）。结论 Galectin-8对内皮细胞的增殖具有促进作用，且在细胞种植前预铺蛋白固定后能够显著增加内皮细胞的黏附，而胞内Galectin-8过表达则抑制细胞黏附。

组织工程心脏瓣膜的研究进展

组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)理论上能克服机械瓣及生物瓣的不足,具有广阔的发展前景.目前组织工程心脏瓣膜的研究主要集中在瓣膜支架材料的选取及制备、种子细胞的选择和种子细胞的种植及培养等三方面.本文将分别就这三方面研究进展进行介绍,分析目前存在的问题,并对其应用进行展望.

诱导多功能干细胞技术制备内皮细胞构建患者组织工程瓣膜的实验研究

目的 探讨利用诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSc)技术重新编码人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast,HSF),诱导分化为内皮细胞(endothelial cell,EC)作为种子细胞;以及以脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架,体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)的可行性.方法 原代分离培养患者HSF细胞,制备携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC基因的慢病毒上清感染HSF细胞,观察感染后细胞形态变化.碱性磷酸酶(AP)染色、细胞免疫荧光染色检测鉴定产生的HSF-iPSc.随后用诱导培养液在体外定向分化HSF-iPSc,Western blot检测分化过程中中皮标志物的表达;分化结束后,流式细胞术分选C D31阳性细胞,细胞免疫荧光染色检测HSF-iPSc-EC标志物,吞噬实验和成管实验检测HSF-iPSc-EC的功能.制备脱细胞猪主动脉瓣支架,行HE染色和扫描电镜观察.种植HSF-iPSe-EC于主脉瓣支架构建TEHV,采取静-动-静的模式培养,行HE染色和扫描电镜观察,免疫荧光染色检测α-SMA表达.结果 原代HSF经编码后形态与胚胎干细胞类似,AP染色阳性,并表达多潜能标志物Nanog、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81.HSF-iPSc分化为EC过程中,内皮标志物CD31、VE-cad、vWF、eNOS不断上调.CD31阳性分选后获得的HSF-iPSc-EC均表达CD31、VE-cad、vWF、eNOS.同时,HSF-iPSc-EC具有明显的乙酰化LDL吞噬和成管能力.猪主动脉瓣膜细胞被完全脱去,且保留完整的纤维网状结构.构建的TEHV表面上内皮样细胞复层生长,排列有序且黏附良好.另外,种植的HSF-iPSc-EC呈空间特异性的表达α-SMA.结论 研究所得HSF-iPSc-EC可作为构建TEHV理想的种子细胞,初步实现了脱细胞主动脉瓣体外再内皮化的预期目标.

人造心脏瓣膜研究的现状和展望

人造心脏瓣膜置换术是治疗心脏瓣膜病的主要手段,人造心脏瓣膜的研制可追溯至上世纪40年代,Hufnage早开始此方面的研究工作,并于1952年首次应用甲基丙烯球人造瓣膜缝置于降主动脉以治疗主动脉瓣关闭不全,手术虽然失败,但是人类第一次大胆地进行心脏瓣膜置换的尝试.

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的:研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建的影响.方法:酶+去污剂法制备去细胞瓣天然支架,应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP,使GRGDSPC肽与之稳定结合,然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV.实验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣,对照组则为未处理去细胞瓣.体外培养1周后取瓣叶,作苏木精-伊红(H-E)染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA表达.结果:与对照组比较,实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富,羟脯氨酸和DNA含量值增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强.结论:RGD肽表面修饰去细胞瓣,提高天然支架细胞黏附性,促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌,有利TEHV构建.

FnCBD64增强骨髓基质干细胞黏附力的实验研究

目的观察预涂蛋白对细胞黏附的影响,以寻找增强细胞黏附力的有效方法.方法1.取四个96孔板分为四组:Fn、FnCBD64(重组纤维连接蛋白羧基端细胞结合域)、牛血清白蛋白BSA及未预涂组,前三种蛋白分别预涂孔底,未预涂组为对照组.分八个时点,间隔30min,每孔接种骨髓基质干细胞悬液,细胞数为5×104个,MTT检测;2.无菌条件下将脱细胞瓣叶圆片置入12孔板中(心室面向上),分别给予Fn、FnCBD64、牛血清白蛋白BSA预先包埋,未预包埋作为对照组.接种细胞悬液,每只瓣叶种植细胞数为3×105个.在开始种植细胞的第8天取瓣叶进行细胞计数和MTT检测.结果各组随着时间的延长MTT的OD570吸光值增加,组内各时点比较有显著性差异.经Fn和FnCBD64预涂组其MTT的OD570吸光值在各时点均明显高于预涂BSA和对照组.Fn组与FnCBD64组相比无显著性差异.脱细胞瓣叶进行预处理后再种植骨髓基质干细胞,经Fn和FnCBD64预处理组,其细胞计数、MTT的OD570明显高于预涂牛血清白蛋白及对照组.结论Fn和FnCBD64促进细胞的聚集、黏附及增殖,是制备组织工程瓣的有用方法.

RGD肽固定对组织工程心脏瓣膜构建的作用

目的探讨促黏附分子RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)固定去细胞瓣在组织工程心脏瓣膜(TEHV)构建中的作用.方法酶+去污剂法制备去细胞瓣支架,在耦联剂Sulfo-LC-SPDP作用下甘-精-甘-天冬-丝-脯-半胱氨酸(GRGDSPC)肽与之化学结合,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV.体外培养2周后取出瓣叶,作HE染色和扫描电镜观察,检测羟脯氨酸反映胶原含量,检测DNA反映细胞增殖,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶(LOX)mRNA的表达.结果与对照组比较,经肽固定的实验组瓣膜细胞密集且组织致密,羟脯氨酸和DNA含量增高,Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强.结论采用RGD肽表面修饰去细胞瓣,不仅可显著提高支架黏附性,而且可促进细胞生长和胶原分泌,有利于TEHV的构建.

脂联素保护大鼠骨髓间充质干细胞抵抗流体剪切力的研究

目的:探究骨髓间充质干细胞(BMSCs)在组织工程心脏瓣膜(TEHVs)上的附着状态及脂联素(APN)对BMSCs抗流体剪切应力(FSS)的影响.方法:利用全骨髓法分离培养BMSCs并进行鉴定.首先使用平板流体腔模型,将BMSCs分为对照组、7.5 dyne/cm2组、15 dyne/cm2组和30 dyne/cm2组,接受FSS 24 h后观察细胞形态并检测凋亡相关指标.然后将BMSCs细胞分为5组:对照组、15 dyne/cm2组、10 μmol/L APN+15 dyne/cm2组、20 μmol/L APN+ 15 dyne/cm2组和30 μmol/L APN+-15 dyne/cmn2组,各组在DMEM或APN预处理24 h,进而接受FSS 24 h后观察细胞形态,检测细胞增殖能力及Bax和Bcl-2的蛋白表达情况.结果:与对照组相比,不同强度的FSS可以显著抑制BMSCs细胞活力、下调Bcl-2表达并且上调Bax表达,并且呈现强度依赖性.与15 dyne/cm2组相比,APN预处理可以显著改善细胞形态,增强细胞增殖能力,上调Bcl-2表达,抑制Bax表达.结论:APN预处理能显著减轻BMSCs细胞接受FSS后的损伤,该过程与凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax密切相关.

聚乙二醇载药缓释微球复合去细胞瓣制备组织工程心脏瓣膜支架

目的:制备聚乙二醇(PEG)载药缓释微球复合去细胞瓣组织工程心脏瓣膜(TEHV)支架.方法:制备PEG微球,电镜观察粒径.去细胞瓣与PEG微球偶联,吸附转化生长因子(TGF-β1).行ELISA检测,分子生物学、形态学和生物力学检测.结果:PEG微球粒径(42.72+3.48)nm.酶联免疫吸附检测示缓释效果明显,7 d TGF-β1释放率67.22%,PEG微球的TGF-β1包封率为82.01%.与单纯去细胞瓣膜比较,复合支架羟脯氨酸含量和DNA含量无显著变化,形态学检测显示复合支架细胞外基质联合紧密,胶原纤维结构紧凑,且瓣叶生物力学性能提高.结论:制备PEG TGF-β1缓释微球去细胞瓣复合支架可行.

转化生长因子β1缓释微球对体外P3/4HB无纺支架细胞生长的影响

目的:研究转化生长因子β2(TGF-β1)壳聚糖缓释微球对体外3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯(P3/4HB)无纺支架培养肌成纤维细胞的作用.方法:静电纺丝法制备P3/4HB无纺支架,接种大鼠肌成纤维细胞.在实验组培养基中分别加入TGF-β1.缓释微球和TGF-β1,体外培养1周后行扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量;并用ELISA法动态检测TGF-β1缓释微球缓释效果.结果:TGF-β1可从缓释微球中缓慢释放,1周内微球释放率为40.6%.与对照组比较,实验组细胞生长紧密,羟脯氨酸及DNA含量增高.结论:TGF-β1壳聚糖缓释微球可在体外稳定释放,并具有生物学活性;其运用于P3/4HB无纺支架,可促进细胞增殖和胶原合成,为研究为制备携带壳聚糖TGF-β1缓释微球的组织工程复合支架打下了良好的基础.

枝状化聚乙二醇修饰的去细胞猪主动脉瓣膜内皮化的性能研究

目的 观察枝状化聚乙二醇(PEG)修饰后的去细胞猪主动脉瓣(DPAV)的内皮细胞生长性能.方法 自合成枝状化聚乙二醇(4-arm-PEG-acrylate),采用核磁共振氢谱(1HNMR),对复合物进行表征检测,利用4-arm-PEG-acrylate上的丙烯酸酯与巯基化的DPAV结合对其进行PEG化,体外获取人脐静脉内皮细胞,以细胞密度为1×105接种于各组瓣膜支架材料上,8d后MTS试剂、苏木素-伊红(HE)染色、扫描电镜(SEM)评价内皮细胞的生长.结果 1HNMR(D2O):3.51～3.86 ppm处PEG信号峰,4.14(4H,CH2OAr),5.80 ～6.48 ppm处丙烯酸酯双键.SEM可见枝状化PEG修饰的DPAV胶原纤维交联增粗,人脐静脉内皮细胞在DPAV上种植8天DPAV组细胞数为(0.88 ±0.03)×105/cm2,PEG-DPAV组细胞数为(1.18 ±0.04)×105/cm2,PEG-DPAV组高于DPAV组(P＜0.05).HE染色和SEM可见两组瓣膜支架表面仅有散在的细胞存在,呈梭形或不规则形,细胞数PEG-DPAV高于DPAV组,部分可见细胞间连接紧密形成一层近似融合的细胞层,但细胞紧密连接不连续.结论 枝状化PEG修饰的去细胞猪主动脉瓣膜能够提高内皮细胞的黏附增殖,但却不能在去细胞瓣膜支架表面形成一层完整的融合层,因此PEG化的瓣膜并不能达到理想的内皮化,有必要进行进一步修饰.