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彗星试验琼脂糖凝胶片保存方法研究
单细胞凝胶电泳技术检测环境因素致DNA损伤具有很高的灵敏性,已在国内外广泛用于职业危险因素引起的人群健康效应研究[1].国内多数现场与实验室距离较远,不具备荧光显微镜和图像存储设备,因此极大地限制了该技术的应用和推广.湿片在保存和运输方面困难较大,并且储存时间越长,DNA扩散的可能性就越大,结果越不稳定.找到一种稳定可靠的凝胶片保存方法,是将该方法推广应用于现场工作的迫切需求.国内有文献报道使用冷冻法保存凝胶片,但只能保存2~3天.国外已有研究使用甲醇脱水干燥法和乙醇脱水干燥法保存凝胶片,但尚没有系统的研究这两种脱水干燥法对琼脂糖凝胶片保存的影响[2, 3].本研究比较了乙醇和甲醇两种脱水干燥法对凝胶片保存的影响.
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Milestone 的创新性工作
为缩短实验室样本制备时间,Milestone采用具有创新性的微波技术和特殊的温度探头设计出第一台超速微波组织处理仪URM.利用微波加速试剂对样本的渗透和加热作用,可以明显缩短实验室样本周转时间.Milestone微波组织处理方法中采用了多项国际专利技术, 改变了脱水模式,仅仅用95%乙醇进行脱水,并用异丙醇替代毒性较强的二甲苯.考虑到各种组织脂肪含量的不同,我们设计出两种基本的工作流程.对含中少量脂肪的组织可采用以下4个脱水步骤:(1)95%乙醇脱水;(2)异丙醇乙醇透明;(3)在较低功率微波条件下真空干燥;(4)浸蜡.为解决脂肪含量较多的组织不易吸收微波和脱水困难的问题,Milestone研制开发了一种脱水试剂JFC.JFC是由乙醇、异丙醇和长链碳水化合物组成的混合溶液,对脂肪含量较多的组织能取得理想的脱水效果,组织处理流程仅需3个步骤:(1)用JFC同步脱水与去脂透明;(2)真空干燥,避免组织损伤;(3)在预先设定的真空条件下进行浸蜡,这个过程同时还可以抽出残余的微量JFC.所以石蜡不受污染,可重复使用数次.
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骨连接蛋白在正常牙髓和修复性牙本质形成中的基因表达
骨连结蛋白(osteonectin,ON)是一种重要的非胶原糖蛋白,可能参与了牙本质的生物矿化过程[1]。我们利用原位杂交技术,观察ON在正常牙髓和牙髓修复过程中的基因表达特征,探讨ON在修复性牙本质形成中的作用。 1.材料与方法:分别在Wistar大白鼠(体重150~250 g)的上下颌第一磨牙近中面制备单面洞,术后第3及15天处死动物。迅速分离上下颌骨,4%多聚甲醛4℃下固定,10%EDTA脱钙,系列乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,5 μm连续切片,4℃下保存备用。实验中所有试剂均由含DEPC水配制以消除RNA酶的作用。利用T7 RNA多聚酶(Boehringer Mannheim公司)体外转录体系合成ON单链RNA探针,地高辛标记RNA检测试剂盒(Promega公司)标记。根据Holland等[2]的方法将标本与已标记探针进行原位杂交。DAB显色,苏木素淡复染。光镜下检查呈棕色的阳性杂交信号。 2.结果:正常对照的大鼠第二磨牙,杂交信号主要表达于成牙本质细胞层内,成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达,但信号强度低于成牙本质细胞。固有牙髓内的牙髓细胞信号较微弱或不表达。术后3 d组标本可见窝洞下方的成牙本质细胞表达呈强阳性,成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达。固有牙髓内的牙髓细胞也呈阳性表达。前期牙本质和牙本质内表达阴性。15 d组标本,可见修复性牙本质形成。修复性牙本质下方的细胞无极化,缺乏典型的成牙本质细胞表型,为成牙本质细胞样细胞。在成牙本质细胞样细胞内,ON表达阳性,染色均匀。可见扩张的牙髓毛细血管内皮细胞也表达阳性。
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乙醇脱水干燥法彗星实验琼脂糖凝胶片保存时间的研究
单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤具有很高的灵敏度,已广泛用于职业危险因素引起的人群健康效应研究[1].因为多数现场与实验室距离较远,或不具备荧光显微镜和图像存储设备,所以限制了该技术的应用和推广.
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正丁醇脱水制作肝组织石蜡切片
肝、脾组织的细胞成分较多,细胞间隙较大,纤维结缔组织较少,其质地较脆,在采用乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋组织块时,常因脱水和透明的时间略长,而造成肝脾组织的石蜡切片易碎或在光镜下出现大量的裂纹而影响形态学的观察.因此,我们采用不同浓度的正丁醇替代乙醇和二甲苯的脱水和透明作用,所制作的肝组织石蜡切片有效地避免了上述的缺陷.
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浅谈粘膜免疫机制
粘膜的防御作用日益受到重视,并定义为粘膜相关淋巴组织.机体的淋巴组织50%以上存在于粘膜系统.其中主要存在于肠道淋巴组织,如果将肠管纵向剖开,用无水乙醇脱水几日后,再放入甘油中,肠管就会变得透明,透过光线就可看到肠壁中的孤立淋巴结如同满天星斗那样多.集合淋巴结如同姆指甲大,也彼彼皆是.粘膜免疫系统具有重要而独特的功能,被认为是执行局部特异性免疫功能的主要场所.
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苯胺蓝、核固红肾组织染色法
由于肾执行功能的复杂性而决定了组织结构的复杂性.在教学中用常规染色方法不易观察与区分肾各部分结构,影响教学结果.经过多次实验与摸索,用苯胺蓝、核固红对肾组织进行染色,取得了较满意的结果.1材料与方法1.1材料健康成人肾,Zenker固定液固定24~48h,常规脱水透明,石蜡包埋.1.2方法(1)石蜡切片4~6μm,切片脱蜡;(2)入1%高碘酸15min;(2)蒸馏水洗2次,入亚硫酸钠溶液(亚硫酸钠10g,加蒸馏水40ml,溶解后加100%乙醇10ml)12h;(4)蒸馏水冲洗数次,入核固红染液1h;(5)蒸馏水洗1min,入苯胺蓝染液(水溶性苯胺蓝1g,溶于1.5%磷钨酸水溶液)染15min;(6)70%乙醇洗去复色;(7)各级乙醇脱水;(8)二甲苯透明;(9)中性加拿大树胶封固.
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乙醇脱水制乙烯关键工程技术研究通过专家评议
2014年7月7日,由上海工程公司联合上海石油化工研究院、四川维尼纶厂共同承担的乙醇脱水制乙烯关键工程技术研究,通过中国石化科技部组织的专家评议。
乙醇脱水制乙烯是中国石化打造纤维素制乙醇下游技术产业链科技开发项目,上海工程公司负责由工业侧线的工程化研究及工程设计,2014年3月,装置完成装置考核,侧线试验结果表明,工艺流程合理,反应器结构设计合理乙醇单耗为1.75t/t乙烯(折100%纯乙醇),乙烯产品纯度大于99.78%(v),优于合同值。目前,试验装置运行平稳,可为大型工业装置设计、建设、开工和运行,提供技术支持。 -
褪黑素受体mRNA检测方法的建立
1 方法介绍1.1 组织标本制备待检新鲜组织标本立即用4%多聚甲醇DEPC液固定,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋组织,置4℃冰箱贮存待检测.1.2 原位杂交检测方法1.2.1 载玻片的预处理载玻片盐酸浸泡24 h,流水洗净,蒸馏水洗后晾干,用95%乙醇浸泡30 min,180℃烘干过夜,室温冷却,涂切片粘合剂.1.2.2 探针制备 LB培养基各50 ml,分别加入mt1、和MT2受体探针大肠杆菌菌株甘油保存液各15 μl,37℃,200 r/min培养过夜.10 000×g离心5 min回收大肠杆菌,按照华舜公司质粒抽提纯化试剂盒说明抽提纯化质粒,将两种质粒以XhoⅠ、HindⅢ内切酶酶切消化2 h,琼脂糖凝胶电泳,回收1.1 kb左右的片段胶,地高辛标记探针(按宝灵曼公司说明书进行),并测定标记效率,探针浓度均达到80 ng/μl.
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双重组化法在一氧化氮合酶与糖元显示中的应用
一氧化氮合酶(NOS) 为一含铁的单氧化酶,可催化左旋精氨酸转化为瓜氨酸和NO.而阿霉素(ADR)是一种有效的广谱抗肿瘤药物,由于其心脏毒性作用,使临床应用受到限制.我们在探讨阿霉素对心脏损伤病理机制的实验研究中,用双重组化法同时显示心室肌NOS与糖元获得成功,现报道如下:1.材料和方法:1.1 动物模型新西兰纯种白兔于耳缘静脉注射ADR,每次2mg/ kg,ADR以生理盐水稀释成1mg/ml,每周一次,共八周,做心室肌损伤模型.取心室肌组织做冰冻切片,厚12μm.1.2主要试剂(1)还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d);(2)四唑仑硝基兰(NBT);(3)0.5%过碘酸氧化液;(4)Schiff液:先将200ml双蒸水煮沸,微火,加入1g碱性复红,再煮沸1min.冷却至50℃加入20ml 1N盐酸,待35℃时加入1g偏重亚硫酸钠. 室温中静置5小时,变为无色液体后装入棕色瓶内并封口,放入冰箱避光保存待用.1.3 双重组化法.(1)将冰冻切片置入丙酮固定1min;(2)经pH7.4 PBS液清洗三次,每次5min;(3)入NADPH-d与NBT配制的孵育液,37℃恒温孵育 1h;(4)经pH7.4 PBS液清洗三次,每次3min;(5)入0.5%过碘酸氧化10~20min;(6)经pH7.4 PBS液充分清洗;(7)入Schiff 液10min液10min;(8)流水冲洗10min;(9)无水乙醇脱水;(10) 二甲苯透明,中性树胶封片.1.4单一组化法显示NOS.(步骤参照双重组化法1~4 步)1.5单一组化法显示糖元.(步骤参照双重组化法5~8步).2.实验结果:2.1双重组化法显示心室肌中NOS呈蓝色、糖元呈红色.2.2单一组化法显示心室肌中NOS呈蓝色.2.3单一组化法显示心室肌中糖元呈红色.结论:通过三组切片的比较,发现使用两种方法所显示NOS与糖元的颜色及其深浅无明显变化.3.意义3.1用双重组化法可以同时显示心室肌NOS和糖元.此法与单一显示NOS组化法和单一显示糖元组化法进行比较,结果显示NOS与糖元的颜色均无明显改变.此结果说明两组试剂的染色过程不产生交叉影响.3.2 使用双重组化法能够同时显示NOS与糖元,不仅节省时间、试剂,还可减少工作量.此方法在实验过程中易于操作、便于观察、利于对比,具有实用性.可以在医学研究中使用和推广.
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睾丸、附睾和眼球在乙醇内长期保存后的密度与体积变化
笔者近对比研究了SD大鼠睾丸、附睾和眼球在新鲜状态下、经Bouin液浸润固定24-36小时后以及经70%乙醇脱水3-7天、保存1-3月后的密度与体积的变化[1].考虑到人们有时需要长期保存标本,有必要了解器官长期保存后的密度与体积变化.因此,本研究利用前期研究[1]中所剩的部分标本以及同期取材并经相同处理(新鲜取材、Bouin液浸润固定24小时、70%乙醇脱水与保存)的部分其他标本,根据以前所述方法[1],继续测量了以上器官在乙醇内(脱水)保存11月后的密度与体积,并将之与新鲜状态以及固定并脱水保存3月后的结果进行了比较.