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用改良地高辛标记原位杂交方法检测Ly49CmRNA表达
由Ly49C在细胞免疫调节中传导抑制性信号,推测该分子与移植免疫耐受有关.国内外大多数的研究是用单克隆抗体方法检测该分子的膜表达,但是试剂价格昂贵,且需要特殊实验设备(如免疫荧光显微镜、流式细胞仪等),不利于推广应用.我们根据核酸杂交原理,从减少组织细胞的破坏、降低成本两方面,对地高辛标记原位杂交方法进行了改良,并应用改良后的原位杂交方法在培养细胞的甩片上检测Ly49CmRNA的表达,具有特异、清晰、低成本、简单等特点[1].介绍如下.
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用免疫组化及原位杂交方法检测鼻咽癌EBV的比较
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种在我国南方地区发病率较高的头颈部恶性肿瘤,其病理分型95%属于非角化鳞癌.EB病毒属于疱疹病毒γ亚科嗜淋巴病毒属的DNA病毒,大量研究认为它与鼻咽癌特别是非角化型鼻咽癌关系密切.我们同时用免疫组化和原位杂交方法检测10例鼻咽癌石蜡切片中的EB病毒,观察和比较两种方法的检测结果,以及鼻咽癌与EB病毒感染的关系.
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骨桥蛋白mRNA与转录因子OCT2 mRNA在胃癌组织中表达的组织芯片研究
我们应用组织芯片技术,通过原位杂交方法检测胃癌组织中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及转录因子OCT2的表达水平,探讨它们与胃癌各临床病理指标及预后的关系.
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端粒酶hTR基因在石蜡包埋肝脏活检组织中的原位杂交检测
为了探讨肝脏活检组织中端粒酶RNA基因 hTR表达与肝炎病毒表达的关系,及hTR与肝癌发生的关系,我们用原位杂交方法分析了70份石蜡包埋肝脏疾患组织中的hTR活性表达,及HBV HCV和HAV-IgmAb的检测结果,并与癌旁及正常组织进行比较,其中46份针吸活检肝组织:包括20份肝细胞癌,14份肝硬化,12份慢性肝炎;24份手术切除的肝细胞癌组织;2份尸解死婴肝脏组织做正常对照.
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病毒性心肌炎原癌基因c-fos的表达
原癌基因c-fos参与了细胞的生长、分化和信息传递,它在某些疾病和病理生理过程中表达增加,可能参与其发生与发展.有关病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中c-fosmRNA的表达目前罕见报道.本研究就是利用免疫组化方法和原位杂交方法探讨原癌基因c-fos的mRNA及蛋白质在小鼠VMC心肌细胞中的表达.
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TGF-β1和smad4mRNA在慢性肝炎、肝硬化、肝癌癌旁组织的表达及意义
目的:转化生长因子TGF-β1信号转导通路具有重要的细胞调节功能,包括细胞的生长、分化、黏附、转移、细胞外基质的形成及免疫调节等.通过检测慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌癌旁病理组织TGF-β1和smad4mRNA的表达,探讨TGF-β/smad通路在肝纤维化形成、发展中的关系及作用机制.方法:应用免疫组化和原位杂交方法,对照肝组织10例,肝癌癌旁肝组织17例,慢性病毒性肝炎肝硬化肝穿组织70例的TGF-β1蛋白和smad4mRNA表达进行检测.结果:TGF-β1和smad4mRNA在慢性病毒性肝炎中度及肝硬化组织中的表达明显增强,阳性率分别为83.3%,87.0%和87.5%,87.0%,明显高于对照组(20.0%,20.0%),差异均有显著性(b3P<0.01,X2=12.3 980;t4P<0.01,X2=14.0 609;和b1p<0.01,X2=14.6 953;b2P<0.01,X2=14.0 609);而癌旁肝组织二者的表达均低下,与对照组无明显差异;随着肝纤维化的发展TGF-β1和smad4mRNA的表达呈逐渐增强趋势,S3期达高峰,S4期有所回落;二者表达呈正相关(X2=4.5 064,P=0.0 336,r=0.2 668);肝组织病理可见TGF-β1和smad4mRNA的阳性细胞在肝组织切片上的分布基本一致,大多集中于汇管区、肝窦及纤维条索周边.结论:TGF-β/smsd信号传导通路在肝纤维化的形成和发展中具有重要的促进作用,TGF-β1和smad4mRNA的组织定位检测能准确的评价肝纤维化形成状况及发展趋势.
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食管癌发生发展过程中RAR-βmRNA的原位表达
目的:研究RAR-β mRNA在食管癌发生发展过程中的作用,探讨维A酸(RA,retinoid acid)在食管癌高危人群中化学预防和化学治疗中应用的可行性.方法:应用原位杂交方法检测了食管癌70例(原位癌30例,鳞状细胞癌20例,腺癌20例)及增生性病变97例(单纯增生19例,不典型增生Ⅰ-Ⅲ分别为20例,39例,38例)和正常食管黏膜鳞状上皮组织19例中RAR-β mRNA表达情况.结果:在正常食管黏膜上皮、单纯增生、不典型增生上皮总体及其Ⅰ-Ⅲ、原位癌、侵袭性鳞状细胞癌及腺癌中RAR-β mRNA表达的阳性率分别为100%(19/19),94.7%(18/19),90%(18/20),69.2%(27/39),68.4%(26/38),63.3%(19/30),60%(12/20),60%(12/20).正常食管黏膜上皮较不典型增生总体、原位癌和侵袭癌组织均有显著性差异(P<0.05).结论:RAR-β mRNA达的丢失与食管癌的发生发展有关,用RA对表达RAR-β高危人群进行化学干预可能会得到预期效果.
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胃癌组织中转化生长因子和血小板源生长因子表达的意义
目的:研究转化生长因子(TGF-β1)、血小板源生长因子(PDGF-A)在胃癌中表达及其与预后的关系.方法:应用免疫组织化学方法和分子原位杂交方法检测有随访资料的101例胃癌手术切除标本中的TGF-β1蛋白、PDGF-A蛋白及mRNA表达.结果:在101例胃癌手术切除标本中TGF-β1阳性表达者48例(47.5%).TGF-β1表达阳性率:有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(X2=4.4431,P<0.05);脉管内有癌栓者明显高于无癌栓者(X2=9.8568 P<0.01);癌组织浸润程度:粘膜及粘膜下、肌层、浆膜下及浆膜,三者比较有显著性差异(x2=7.4799,P<0 05);组织学分级之间比较有显著性差异(x2=9.1160,P<0.05).PDGF-A阳性表达者43例(42.6%).PDGF-A表达阳性率:有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(x2=5.5702,P<0.05);脉管内有癌栓者明显高于无癌栓者(x2=8.8080,P<0.01);癌组织浸润程度:粘膜及粘膜下、肌层、浆膜下及浆膜,三者比较有显著性差异(X 2=14 0504,P<0.01)PDGF-A阳性表达者5a及10a生存率明显低于阴性表达者5a及10a生存率(P=0 0174,P=0.0038),说明PDGF-A阳性表达者预后较差,阴性表达者预后较好PDGF-A mRNA表达(61.5%)与PDGF-A蛋白表达(42 6%)一致PDGF-A阳性表达与TGF-β1阳性表达之间无关(P>0 01),但他们阳性表达与胃癌组织病理学关系有一致性结论:PDGF-A、TGF-β1阳性的胃癌恶性度高、易转移、预后差,PDGF-A与TGF-β1可能有协同作用.PDGF-A作为判断胃癌预后的指标之一.
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三氧化二砷抑制肝癌细胞端粒酶表达及诱导细胞凋亡作用
目的:观察三氧化二砷对体外培养的人肝癌细胞株细胞端粒酶表达和细胞生长抑制的影响及诱导细胞凋亡的作用,探讨三氧化二砷的抗肿瘤作用及机制.方法:采用噻唑蓝比色分析法(MTT法),流式细胞分析,原位杂交方法以及TUNEL原位末端标记法观察和检测了不同浓度的三氧化二砷对人肝癌细胞株(SMMC-7721)细胞的增生,细胞DNA含量的分布,细胞端粒酶表达的影响及细胞凋亡的诱导作用.结果:20,5,5 μmol/L三氧化二砷在24,48,72 h时抑制率分别为22.0%,25.7%,32.0%,均能明显抑制人肝癌细胞株细胞的增生(单侧置信区间为10.1,23.7,18.0,P<0.05).流式细胞分析显示加药组G0/G1期细胞比例减少,S期细胞所占比例增高.随着药物浓度的增加细胞端粒酶的表达下降,而凋亡细胞数增加.结论:三氧化二砷能抑制人肝癌细胞增生,其抑制作用具有时间-计量效应关系,并能抑制肝癌细胞端粒酶的表达及诱导肝癌细胞凋亡.
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survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究
目的:采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的抑制作用.方法:针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN);采用脂质体介导survivin ASODN转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,western-blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,检测转染前后细胞贴壁率及细胞生长抑制率变化,绘制细胞生长曲线.结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后survivin蛋白及mRNA表达分别从69.59及75.61降低至10.71及22.94,细胞贴壁率从90.68%降低至33.16%,细胞凋亡率从0.7%增加至31.35%,均有显著差异.转染后对细胞生长的抑制作用可以维持大约1 wk,在转染后第3 d抑制率高可达71.8%.结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.
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胃癌及癌前病变中hTERT基因和C-mye蛋白的表达意义
目的:探讨胃癌及癌前病变中端粒酶逆转录酶(hTERT)基因和c-myc蛋白的表达及相互关系.方法:以41例胃癌和25例相应非癌组织为研究对象,采用免疫组化和原位杂交方法检测c-myc蛋白、hTERT蛋白和hTERTmRNA,并对各指标阳性表达率和相关性进行比较分析.结果:正常胃黏膜-肠型化生-异型增生-胃癌中,c-myc蛋白的阳性率分别为0,30%,53%,59%;hTERTmRNA的阳性率为10%,39%,67%,85%;hTERT蛋白为0,30%,60%,78%.三者在异型增生、胃癌中分别与正常组相比差异有显著性,而且肠化与胃癌组比较也分别具有显著性(P<0.05).胃癌中,c-myc和hTERT蛋白的表达在低未分化、进展期、有淋巴结转移和浸润至浆膜层的肿瘤中显著增高(P<0.01~0.05).而hTERTmRNA的表达仅与肿瘤分期有关.肠化、异型增生和胃癌三组中,c-myc和hTERTmRNA及hTERTmRNA和蛋白间分别具有显著性正相关(rs=0.504~0.696,P<0.05).结论:c-myc和hTERT的过表达是胃癌发生中的早期事件,其表达水平随着胃癌恶性程度的增加而增加;c-myc在转录水平上激活hTERT的表达,可能是胃癌发生发展的重要阶段.
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丙肝病毒C蛋白与癌基因在肝门部胆管癌组织中的表达及意义
近年肝门部胆管癌(HC)的发病率、死亡率呈逐年升高的趋势,已占肝外胆管癌的58%~75%,且发现HC合并HCV感染患者日益增多.我们应用免疫组化和原位杂交方法对68例HC组织中丙肝病毒(HCV-C)、K-ras、N-ras、H-ras蛋白及C-myc mRNA进行了检测,以探讨HCV在HC中的致癌机理.
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树状DNA原位杂交技术在子宫颈癌人乳头状瘤病毒DNA分型检测和细胞学定位中的应用
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)是一种环状双链DNA病毒,其基因组大小为7.9 kb.目前,传统的细胞学和血清学方法诊断率较低,特异性欠佳.树状DNA杂交(DDH)技术是一种信号放大技术,它通过增加标记探针的拷贝数或标记物的信号强度来提高敏感度[1],具有与PCR技术相似的高敏感性.本研究采用以4层单体组成的3DNA树状体作为靶序列探针载体的DDH技术,并结合原位杂交方法,对45例临床诊断为宫颈癌患者的癌组织分别进行HPV16、18DNA检测,并就提高杂交敏感性的方法学做进一步探讨,为临床推荐一个行之有效的新方法.
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喉癌组织中人乳头状瘤病毒感染与p15和p16蛋白的表达
人乳头状瘤病毒(human papillomavivus,HPV)与喉鳞状细胞癌(简称喉鳞癌)的发生有相关性已被肯定.我们采用原位杂交方法与免疫组化方法,分析HPV感染与p15、p16蛋白表达之间的相关性,以进一步明确喉鳞癌的病因及发病机制.
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髁突软骨的细胞分层及其功能研究
我们通过对髁突软骨细胞进行PCNA、FGFR3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体基因表达等研究,探讨髁突软骨的分层及其功能.1.材料和方法:成年日本大耳白兔共6只,雌雄各半.处死动物后,取TMJ标本, HE染色和免疫组化标本用多聚甲醛固定,EDTA脱钙,石蜡包埋.免疫组化采用超敏SP法.抗FGFR3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司(美国), 抗PCNA单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(购自福州迈新公司).基因序列、引物设计、RNA探针制备和原位杂交方法同以前的研究[1].
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p16、p21和cyclin D1 mRNA在皮肤鳞癌中的表达
细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究的热门课题之一,在细胞发生恶性转化过程中,细胞周期中的许多因子参与这一过程,如cyclin D1、p16和p21等蛋白,这些蛋白可单独或协同促进恶性肿瘤的发生和发展.为了探索p16、p21和cyclin D1与皮肤鳞癌发生的关系,我们采用原位杂交方法对22份皮肤鳞癌(squamous cell carcinoma, SCC)标本进行了研究分析.现将初步研究报告如下.
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淋巴样增强因子-1在恶性黑素瘤组织中的表达及意义
Wnt信号转导通路在多种肿瘤的发生、发展中发挥作用,淋巴样增强因子(LEF)-1作为其中关键因子,具有重要功能.本研究应用免疫组织化学和原位杂交方法,检测LEF-1蛋白、mRNA在恶性黑素瘤中表达情况及临床病理特征,探讨LEF-1在黑素瘤发生、发展中的作用及意义.
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宫颈癌和癌前病变中脆性组氨酸三联体缺失与人乳头瘤病毒16/18感染的相关性研究
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,在我国妇科恶性肿瘤中发病率居第一位[1]。重度宫颈癌前病变(CINⅢ)中有12%~50%不经治疗能进一步发展成为浸润癌,高危型人乳头瘤病毒(HPV )(HPV16/18)感染与宫颈癌的相关性已被广泛接受,流行病学研究显示从感染高危 H PV开始至发展为宫颈癌的时间间隔大约为20年左右,由此可见单一的H PV感染并不足以导致宫颈细胞的恶性转化,除了H PV感染,宫颈癌的发病过程中可能还存在许多未知的因素。脆性组氨酸三联体(FHIT )基因是近年来新发现的一种抑癌基因,位于3 P14.2,其主要功能是参与 DN A 修复和细胞周期的调控,而宫颈癌细胞在3号染色体短臂,尤其是3p13-21.1区域存在高频率的等位基因缺失,这就提示FHIT 基因与宫颈癌的发生、发展有一定的关系,但各家报道不一[2,3]。本实验采用组织芯片技术及原位杂交方法检测了正常宫颈上皮、宫颈癌前病变及宫颈浸润性鳞状细胞癌中 H PV16/18的感染情况;运用聚合酶链反应(PCR)检测了FHIT 基因在其中的存在情况,以期了解FHIT 基因在宫颈上皮癌变中的作用,同时通过比较宫颈组织中HPV16/18感染与FHIT基因缺失的关系,进一步探讨二者在宫颈癌发生、发展中的相关性。
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结合珠蛋白mRNA在小鼠皮肤中的表达及炎症调节
结合珠蛋白(Haptoglobin,Hp)是一种急性期蛋白,具有结合血红蛋白、抗菌、促进血管生成和参与免疫反应等功能[1].Hp主要在肝脏合成,也可以在肝外脏器中表达[2-4].D′Armiento J等采用Northern 杂交方法发现:正常小鼠皮肤组织中有Hp mRNA表达,受到细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的炎症诱导后表达明显增强[5].但是Hp究竟在皮肤的哪一部分组织或细胞中转录或合成及其在皮肤局部可能发挥的生物学功能尚未可知.本研究采用RT-PCR的方法研究了小鼠表皮、真皮及表真皮组织中Hp mRNA的表达,并采用原位杂交方法进行了定位观察,现将结果报道如下.
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肝硬化患者血清NO、TNF-α及肝组织中诱导型NO合成酶的表达
我们采用原位杂交方法、硝酸还原酶法、酶联免疫吸附试验(ELISA)一步夹心免疫法对22例肝炎肝硬化患者肝组织中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS mRNA)表达的情况和50例肝炎肝硬化患者血清中NO、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平进行了测定,现将结果报道如下.