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1-14 低氧处理对肝癌细胞生长和NQ01酶活性的影响
目的研究低氧环境下肝癌细胞生长是否被抑制,胞内Ⅱ相解毒酶NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQ01)活性是否被诱导增高,以及二者之间的关系.方法肝癌细胞SMMC-7721接种于96孔培养板内,5%CO2孵箱培养24h后,换新鲜培养液(已用混合气预先平衡)放入低氧小罐,用5%CO2～95%N2混合气体进行缺氧处理(O2%＜0.1%),分别培养6、9、12、24、36 h后,取出培养板,以MTT比色法检测细胞生长情况;NQ01酶活性采用微孔板直接测定法、细胞数用结晶紫染色法测定,NQ01酶活性结果表达为NQ01酶比活力(specifie activity)=A(NQ01酶活力)/B(细胞数).结果低氧处理6 h后细胞NQ01酶比活力较常氧对照组下降,而细胞生长加快.在9 h后,酶比活力呈现时效性升高,且低氧组酶比活力明显高于对照,而细胞生长则减慢(与常氧对照组比较均为P＜0.01).将细胞生长曲线与酶活时间曲线作相关分析,统计学上差异无显著性.结论低氧处理在短时程内能够刺激肝癌细胞生长加快,抑制胞内NQ01酶活性;而超过这一时间段之后则使细胞生长减缓,诱导NQ01酶活性升高.
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医疗器械细胞毒性试验方法标准化探讨
细胞毒性是医疗器械生物相容性评价的重要项目之一。四唑盐MTT法是经典定量细胞毒性试验方法，该实验研究了细胞浓度、培养时间对试验结果的影响。结果表明应用不同试验条件的MTT法对同一待检物会得到不同的细胞毒性结果，因此标准化MTT试验方法对医疗器械细胞毒性试验评价非常重要。
关键词： MTT法细胞毒性试验 细胞生长曲线 L929细胞系 -
紫芪方含药血清对肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护效应
目的:探讨紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护效应.方法:建立IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型;采用血清药理学方法,在细胞培养液中加入不同给药剂量制备的紫芪方药物血清(给药1次和间隔1 h两次给药10 g·kg-1 DJ-1,SJ-1;给药1次和间隔1 h两次给药20 g·kg-1;DJ-2,SJ-2),和参附药物血清(间隔1 h两次给药20 g·kg-1 SF)及对照血清(C).测定LDH漏出量和其细胞生长曲线.结果:与对照组比较,SJ-1,SJ-2两组制备的药物血清能明显减少IEC-6细胞LDH的漏出量,其中SJ-1(P＜0.05),SJ-2(P＜0.01);SJ-2组24 h细胞活力明显高于缺氧复氧细胞损伤组及参附血清组(P＜0.05),并随时间而逐渐增强.结论:紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤具有显著保护效应.
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基因1b型HCV核心蛋白不同功能区域对HepG2细胞生长的影响
目的 研究基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株编码的核心蛋白(CORE):癌中心株(T)、癌旁株(NT)、C191(HCV-J6)及同一病毒株(T)编码的不同功能区域(1～172、1～126、1～58、59～126、127～172 AA)在HCV致病机制中的作用,为治疗HCV感染提供靶位.方法 将含有3个不同病毒株(T、NT及C191)及T不同功能区域的CORE真核表达质粒,转染到HepG2细胞,用流式细胞仪检测Annexin Ⅴ/PI,并用细胞生长实时观察仪观察细胞生长曲线.结果 基因1b型T、NT、C191和T不同功能区域的CORE均能诱导HepG2细胞凋亡和坏死且抑制了细胞的生长,其中,T诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长强于NT和C191, T的CORE的N端1～58 AA诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长均高于其他功能区域.结论 HCV基因1b型不同病毒株及同一病毒株编码的CORE不同功能区域的分子致病机制存在一定的差异,N端的1～58 AA在CORE的致病机制中起重要作用,可能是基因治疗的重要靶位之一.
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丹参含药血清对肝星状细胞增生的抑制作用
目的:研究丹参含药血清对肝星状细胞(HSC)的增生抑制作用,并探讨中药抗肝纤维化筛选平台的建立.方法:测定HSC-T6细胞的细胞生长曲线和克隆形成率,观察其细胞增生状况.取原始血清体积分数的80%,40%,20%,10%,5%的丹参含药血清作用于HSC-T6细胞,观察其增生抑制效应及量效关系.结果:HSC-T6细胞的细胞群体倍增时间为10.57 h,克隆形成率为82.4%,说明该转化细胞系的活力较好,增生能力较强.在5-80%浓度范围之内,丹参含药血清抑制HSC细胞增生作用呈剂量依赖性(经直线回归分析,相关系数r=0.9487).结论:丹参含药血清能明显抑制HSC-T6细胞增生,呈剂量依赖性.
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survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究
目的:采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的抑制作用.方法:针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN);采用脂质体介导survivin ASODN转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,western-blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,检测转染前后细胞贴壁率及细胞生长抑制率变化,绘制细胞生长曲线.结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后survivin蛋白及mRNA表达分别从69.59及75.61降低至10.71及22.94,细胞贴壁率从90.68%降低至33.16%,细胞凋亡率从0.7%增加至31.35%,均有显著差异.转染后对细胞生长的抑制作用可以维持大约1 wk,在转染后第3 d抑制率高可达71.8%.结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.
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烧伤前后大鼠血清对骨髓基质细胞生物学行为的影响
目的:观察烧伤前后大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学行为的影响,为骨髓基质细胞在创伤修复中的应用奠定实验基础.方法:取Wistar大鼠,处死分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别用含有10%胎牛血清、正常大鼠血清、烧伤后3d大鼠血清和烧伤后14d大鼠血清的F-12培养基培养,用MTT法测定其生长曲线,PI染色,流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率.结果:用含有10%大鼠血清的F-12培养基传代培养的细胞生长曲线相似,但与含有FCS的F-12培养基传代培养的明显不同.前者倍增时间缩短,N组、B1组、B2组细胞群体倍增时间分别为23.7h、18.6h、20.2h.平台期所能达到的细胞总数明显增加.烧伤后大鼠血清处理过的细胞中G0/G1期细胞比例明显低于其它两组,而S期细胞的比例则相反.正常大鼠血清处理过的细胞中G2+M期细胞的比例则比其它组明显升高.大鼠血清处理过的细胞中DNA含量明显高于胎牛血清培养的细胞,而烧伤后的大鼠血清处理过的细胞中DNA含量则明显高于正常大鼠血清处理过的细胞.而烧伤后3d的大鼠血清处理过的细胞的凋亡率比其它组细胞明显升高.结论:大鼠血清比胎牛血清能更好地促进大鼠体外培养的骨髓基质细胞生长;烧伤大鼠血清内可能含有多种能影响骨髓基质细胞生长的物质,且其含量随烧伤的时间改变而变化,对骨髓基质细胞生长的影响是复杂的.
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重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响
目的观察重组人DNMT1真核表达质粒转染对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA表达水平和细胞生长曲线的影响.方法将构建好的正义和反义DNMT1真核表达质粒用脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-939,然后用G418进行筛选,得到阳性克隆细胞株后,用半定量RT-PCR检测DNMT1基因的mRNA水平的变化,用MTT法观察细胞生长曲线.结果正义DNMT1真核表达质粒能使QBC-939细胞中的DNMT1基因的mRNA水平增加,而反义DNMT1真核表达质粒则使其mRNA水平降低;正义质粒可使QBC-939细胞增殖速度加快,反义质粒使其增殖速度减慢.结论重组人DNMT1真核表达质粒转染能影响胆管癌细胞DNMT1基因的mRNA表达水平和细胞生长曲线.
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甲状旁腺相关肽小分子干扰RNA诱导HTB-94软骨肉瘤细胞凋亡
甲状旁腺相关肽(PTHrP)近年来被证实在人体软骨肉瘤细胞中表达[1-3].2006年1月至2007年8月我们将PTHrP小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒稳定转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94后,观察其对HTB-94细胞中PTHrP蛋白、mRNA、细胞生长曲线以及肿瘤细胞的影响.材料与方法
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电离辐射调控脂质体介导的p16基因在HeLa细胞中的表达
目的探讨不同剂量γ射线照射后诱导脂质体介导的p16基因在HeLa细胞中的表达及抗癌作用.方法用脂质体Lipofectamin介导重组质粒Egr-p16转染人HeLa细胞,采用RT-PCR的方法检测了60Co γ射线照射转染后的人HeLa细胞剂量效应和时程变化,用细胞计数检测细胞增殖的变化,用流式细胞术检测细胞周期的变化.结果研究证实0.5～8 Gy照射后p16的转录水平高于对照,在2～4Gy照射后达到峰值,2Gy照射后2～24h高于对照组,在照射后4 h达到峰值,然后逐渐下降.细胞生长曲线显示体外稳定转染联合60Co γ射线照射对HeLa细胞的增殖具有明显的抑制作用.细胞周期变化显示转染后的HeLa细胞经过照射后G0/G1期比例呈现剂量依赖性的下降,而S期则出现剂量依赖性的增加,出现明显的S期阻滞,G2/M期在2Gy出现明显的阻滞,在5和10Gy时逐渐下降,但是仍然高于对照组.结论60Co γ射线可诱导转染的HeLa细胞p16转录水平的增强,同时在细胞增殖上出现明显的变化.
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采用视频系统的细胞原位计数法
在体外细胞培养过程中,细胞生长曲线是反映细胞生物学特性十分重要的指标.传统细胞生长曲线的绘制方法,是通过胰酶消化后制成细胞悬液,显微镜下计数,然后计算出细胞总数[1].这种方法不能在不同时相或用药前后进行自身对照观察,因此我们在实验中采用定位微量细胞培养技术及细胞原位计数法[2],并将视频系统引入该方法中,现简介如下.1 仪器及设备选用菲利浦VR-HD 1000录像机、松下TC-2140监视器、奥林巴斯IX 70倒置显微镜、细胞培养容器(丹麦NUNC 6孔板、12孔板或培养皿)、小玻璃管(外径为6 mm,长为3.5 cm,一端为盲端)、血盖片或普通盖片、投影胶片(非复印型)等.
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软骨肉瘤相关基因Sox9(siRNA)表达质粒的构建鉴定以及对肿瘤细胞生长和凋亡的影响
目的:利用小干扰阻断目的基因的原理将构建的目的基因Sox9的pSilencer3,1-H1 neo siRNA(small interfering RNA)表达质粒转染人体软骨内瘤细胞HTB-94,观察目的基因被阻断后肿瘤细胞目的基因的表达、肿瘤细胞生长和凋亡所受到的影响.方法:设计并合成Sox9(siRNA),鉴定后将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达的变化.以及被转染肿瘤细胞的生长曲线和肿瘤细胞凋亡的情况.结果:Sox9(siRNA)的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致.被转染的HTB-94 Sox9基因的mRNA的表达量下降了35.4%,蛋白的表达量下降了31.3%;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞24h和96h的光吸收值分别为0.146+0.037和0.412±0.036,而正常对照细胞组两个同样时间段的光吸收值分别为0.152±0.0367和0.607±0.029.其中细胞生长增殖速度的差异为32.0%,肿瘤细胞的生长明显受到抑制;Sox9(siRNA)转染HTB-94细胞的干扰组细胞凋亡率为39.2%;而未经干扰的HTB-94肿瘤细胞的细胞凋亡率为0.1%.结论:经过设计合成的Sox9(siRNA)表达质粒可以稳定转染人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞,被Sox9(siRNA)表达质粒转染的人体软骨肉瘤细胞HTB-94肿瘤细胞Sox9基因的mRNA和蛋白的表达都受到抑制,同时肿瘤细胞的生长繁殖也受到明显抑制.肿瘤细胞的凋亡明显增加.
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大鼠Tenon's囊成纤维细胞体外培养及生长特性的研究
目的探讨建立体外大鼠Tenon's囊成纤维细胞的培养方法,并对体外培养的Tenon's囊成纤维细胞的生长特性进行观察.方法选用健康年幼的SD大鼠40只,采用断颈法将其处死,摘除眼球,无菌条件下,分离剪下Tenon's囊组织,采用植块法对Tenon's囊成纤维细胞进行体外培养;通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色技术对其细胞性质进行鉴定;通过细胞记数和MTT法对其生长特性进行研究.结果原代培养的大鼠Tenon's囊组织块接种后,约48 h即可见细胞由组织块中爬出,培养8～10 d,细胞汇合程度大约可达70%左右;培养14-16 d,细胞完全汇合;在细胞汇合程度达到70%-80%时,可以进行细胞传代,传代细胞接种后4-5 h大部分细胞贴壁,10-12 d左右传代细胞完全汇合.光镜下观察,可见Tenon's囊成纤维细胞,在汇合程度低时细胞呈细长梭形外观,汇合程度高时细胞可呈多边形改变.免疫组化染色可见Tenon's囊成纤维细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性.细胞生长曲线显示,在2-8 d细胞处于对数生长期.结论体外成功地培养了大鼠Tenon's囊成纤维细胞,这不仅为青光眼滤过泡瘢痕化防治的基础研究提供了一种新的细胞来源,同时为抗结膜瘢痕化药物的研究和开发提供了一种新的简便实用的细胞来源途径.
关键词： 大鼠 Tenon's囊成纤维细胞 细胞培养 鉴定 细胞生长曲线 -
不同浓度人羊膜匀浆上清液培养大鼠许旺细胞的增殖
背景：许旺细胞是周围神经修复过程的重要细胞，而研究发现人羊膜细胞分泌的多种细胞因子能够促进许旺细胞增殖。
目的：观察不同浓度人羊膜匀浆上清液对鼠许旺细胞(RSC96)生长的影响。
方法：使用含体积分数20%胎牛血清的高糖DMEM培养基原代培养RSC96细胞株，传代至第2代用于实验研究。根据人羊膜匀浆上清液在培养基中的不同体积分数(0，10，15，20，25%)分组。
结果与结论：人羊膜匀浆上清液的总蛋白浓度为675 mg/L，表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子浓度分别为(470.625±2.546)，(4.121±0.026)和(0.172±0.002) ng/L。在培养第1-7天，10%和15%人羊膜匀浆上清液组的增殖率大于20%和25%人羊膜匀浆上清液组(P <0.05)；10%、15%人羊膜匀浆上清液组显示出促进细胞增殖的作用，而20%、25%人羊膜匀浆上清液组显示出抑制细胞增殖的作用；各实验组的细胞活力与对照组接近(P >0.05)。提示人羊膜匀浆上清液低浓度时(10%和15%)具有促进RSC96增殖作用，高浓度时(20%和25%)抑制RSC96增殖。 -
不同血清浓度及培养时间对成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的影响
背景：课题组前期实验曾报道血清及神经生长因子对嗅鞘细胞体外增殖的影响，但对于嗅鞘细胞体外培养的血清浓度的选择及培养时间的掌握，这一方面的实验研究却报道较少
目的：通过研究不同血清浓度及体外培养时间对来源于成年大鼠嗅黏膜的嗅鞘细胞生长曲线的影响，从而了解不同实验条件对嗅鞘细胞体外生存和生长情况的影响。
方法：取成年大鼠嗅黏膜，进行体外分离培养，鉴定嗅鞘细胞，并用磺基罗丹明B酶标仪法测量各孔的吸光值(A值)，转化为嗅黏膜嗅鞘细胞的生长曲线。
结果与结论：血清浓度0%组的A值明显低于其他浓度组。血清浓度10%-90%组细胞均可以正常生长。特别是血清浓度在10%-40%，对细胞生长起到明显的促进作用。随着细胞生长时间的延长，血清浓度0%组A值呈微弱的降低，其余各浓度组A值呈现增加状态。开始几天的A值增加趋势较弱，第9天之后增加趋势明显增强。血清浓度10%-40%组，在第13天，细胞生长迅速增快，第19天左右进入平台期，第23天A值有减弱的趋势。而血清浓度在50%-90%组，在第13天细胞生长达到峰值，随着时间的延长，A值逐渐变小。说明不同血清浓度及不同培养时间等体外培养环境对大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞生长和生存有明显影响，因而利用血清进行体外细胞培养时应充分考虑所添加血清的浓度以及细胞培养的时间。 -
不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学的影响
目的 探讨不同实验条件下不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学变化的影响.方法 采用体外细胞培养技术进行小鼠成纤维细胞L929细胞的培养,并用磺基罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)酶标仪法(A490 nm波长)测量各孔的吸光值(OD值)并转化为小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线.同时,分别采用HE染色法、吖啶橙荧光染色进行小鼠成纤维细胞L929细胞系形态学观察.结果 小鼠成纤维细胞L929细胞系分别在不同浓度的血清中培养2、4、6、8 d,其表现出不同的生长和生存情况及细胞形态学改变.将该细胞系处于相同培养时间和不同血清浓度(0%、20%、40%、60%、80%、100%)时,在20%和40%血清浓度组中,成纤维细胞的生长基本表现为OD值呈现快速增加趋势、且对细胞生长促进作用较强;而血清浓度为0%和100%时对小鼠成纤维细胞L929细胞生长表现出明显抑制作用及OD值呈逐渐减小的趋势.当该细胞系处于不同培养时间、且相同血清浓度时,除0%组OD值呈现减弱趋势,其他浓度组随时间的延长OD值呈增加趋势,在4 d之内OD值增长较快,4~6 d增长趋势减弱,6~8 d增长趋势回升,尤其是100%组.在这种实验条件下,小鼠成纤维细胞L929细胞的形态学也发生了相应改变.结论 不同血清浓度及不同培养时间等体外培养环境对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长和生存及细胞学形态均有明显影响,提示利用血清进行体外细胞培养时应充分考虑所添加血清的浓度以及细胞培养的时间.
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胶体金对K562细胞影响的研究
本文论述了有关人类白血病细胞系K562细胞的体外培养的特点,以及胶体金纳米颗粒独特的物理性质,并应用胶体金治疗肿瘤的原理和意义,成功的在体外条件下培养出生长状态稳定的K562细胞,后通过观察、记录体外生长的状况,绘制了细胞生长曲线,并计算出细胞的倍增时间.利用柠檬酸三钠来还原氯金酸的方法制备了胶体金,通过紫外/可见分光光度计和电子透射显微镜检测了胶体金的吸收光谱以及它的颗粒直径、形状,进行了胶体金颗粒对K562细胞的影响研究.实验结果表明,加入胶体金和没加胶体金的细胞生长状况基本相同.
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高压芒刺静电场抑制人肝癌细胞SMMC7721增殖的研究
目的:研究高压芒刺静电场(high-voltage prick electrostatic field,HVPEF)对肿瘤细胞增殖的抑制作用.方法:分别以电压为6kV、10kV和14kV的HVPEF作用于体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,绘制细胞生长曲线,并用MTT法和流式细胞术检测电场对细胞增殖的抑制效果.结果:HVPEF处理后,各实验组细胞生长受到不同程度抑制,细胞死亡率升高(P<0.01),细胞增殖活性分别降为对照组的75.7%、88.5%和72.2%,且存在统计学差异(P<0.05).结论:一定强度的高压芒刺静电场作用能够有效抑制肿瘤细胞增殖.
关键词： 高压芒刺静电场 人肝癌细胞SMMC7721 细胞生长曲线 细胞相对活性 -
骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化
目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件.方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP),进行定量分析.结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h.阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性.24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态.第3天,NSE和GFAP表达高,分别为67±3.5%和39±1.8%.结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.
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胃癌侧群细胞检测分选及其增殖能力的初步分析
目的 检测和分选胃癌细胞系中的侧群细胞(side population,SP),并对其体外增殖能力进行初步分析.方法 选择3株不同分化程度的人胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、BGC-823,以Hoechst 33342/碘化丙啶(propidium iodide,PI)荧光染料双染.维拉帕米拮抗对照.应用流式细胞仪荧光激活分选法检测SP细胞比例;通过细胞生长曲线(CCK-8法)对SP细胞体外增殖能力进行初步分析.结果 3株胃癌细胞中均存在含量极少的SP细胞,比例在0.8%～2.7%之间;SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度降低而下降(2.20%w 1.57%vs0.93%,P=0.023).人胃癌细胞系MKN-28来源的SP细胞体外培养1周、2周后的增殖倍数分别为22.67和290,明显高于非SP细胞培养后的13.68和124.细胞生长曲线显示,SP细胞体外增殖能力明显强于non-SP细胞及未经分选的MKN-28细胞(P=0.044).结论 胃癌细胞系中存在比例相对稳定的SP细胞,SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度增高而上升.胃癌SP细胞体外增殖能力明显高于非SP细胞.
