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1-04 反式BPDE诱导人支气管上皮细胞恶性转化
目的探索苯并(a)芘代谢物反式BPDE诱导人支气管上皮细胞16HBE转化的理想实验方案,构建恶性转化的细胞模型,为后期进一步研究其致癌分子机制提供理想的材料.方法细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量,以不同剂量反式BPDE 1次或多次处理细胞,观察培养的不同阶段转化灶出现情况,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征,比较各组转化细胞的集落形成率.结果以0.1、0.5、1.0、2.0 μmol/L的剂量,对细胞多次间断染毒,传代15次,是反式BPDE诱导16HBE细胞恶性转化的理想方案.其集落形成率分别为2.0‰o、5.5‰、7.0‰、10.5‰,剂量-反应关系呈现良好的直线相关,r=0.974 1.结论反式BPDE能诱导人支气管上皮细胞16HBE转化,构建理想的恶性转化的细胞模型.
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1-01 c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型
目的建立促癌剂检测模型.方法采用电穿孔的方法,将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后,进一步用促癌剂佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率(CFE)、锚着独立性生长(AIG)、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果 c-Ha-rasV12G基因使细胞对促癌剂的促癌敏感性增强,其中,对于WI-38G418r细胞,当PMA剂量分别为0、3.125×10-5、6.25×10-5、1.25 × 10-4、2.5×10-4及0.5×10-3mol/L时,其在含体积分数为1%FBS的1640培养基中的克隆形成率分别为7、8、11、12、15及14/200 cells,在含体积分数为10%FBS的培养基中分别为76、92、106、109、127及173/200 cells,在质量浓度为0.33%的琼脂中为47、61、70、69、80及97/1 000 cells.选取0.5×10-3 mol/L剂量组处理的G418r细胞进行裸鼠成瘤性实验,结果阳性.对照非基因转染细胞,用0.5×10-3 mol/LPMA处理后,在3种培养基中相应的克隆形成情况为3、33/200 cells,0/1 000 cells,裸鼠皮下注射部位无肿瘤生长.PMA以0、2.0×10-5、1.0×10-4、5.0×10-4、1.0×10-3及1.6×10-3 mol/L分别作用24 h,结果1.0×10-4 mol/L剂量作用使BEAS-2B G418r细胞获得了高的血清抗性及CEF,表现为在含体积分数为0.8%、0%FBS的LHC-8培养基及软琼脂中的CEF分别为190%、150%及75%(对照非基因转染细胞在不含PMA及FBS的LHC-8中CEF计为100%),对照细胞在含体积分数为0.8%FBS的培养基及软琼脂中不能生长,随着PMA处理剂量的增加,其CFE逐渐降低.结论 c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性,其中当PMA剂量≤1.0×10-4mol/L时,可发挥促癌作用,大于该剂量则有促分化作用;上皮细胞发生恶性转化的标志之一是细胞对FBS、PMA等促分化剂的促细胞分化抗性增强.
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提高胚鼠脑源性神经干细胞克隆形成的一种方法
神经干细胞(neural stem cells,NSCs)[1],因其特有的自我更新多向分化潜能、较低的免疫原性、能向病灶迁移等诸多优点而倍受关注.但将NSCs用于治疗疾病还存在很多亟待解决的问题[2,3],神经干细胞的体外获取、增殖和纯化是其中之一.本研究改良一种体外培养和克隆NSCs的方法,旨在获得高的细胞克隆形成率.
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实时动态活细胞成像系统在单克隆筛选和克隆形成能力检测中的应用
目的 利用IncuCyte ZOOM系统筛选肿瘤细胞单克隆和克隆形成能力检测.方法 采用差速消化与差速贴壁分离培养原代肿瘤细胞;在有限稀释法基础上,采用IncuCyteZOOM系统的实时动态追踪和全孔成像技术对肿瘤细胞进行单克隆筛选及克隆形成能力分析.结果 从30例肿瘤组织中培养6株原代肿瘤细胞(TJ3ZX-02至07),进一步从5株原代肿瘤细胞(TJ3ZX-03至07)中成功筛选出89个持续增殖的单克隆,其中67个克隆扩增培养并冻存;并且通过时序图准确有效地排除了18个不能持续增殖的单克隆和28个由2个及以上细胞组成的多克隆.2例单克隆株(TJ3ZX-06-B11,TJ3ZX-07-H11)克隆形成能力分析表明,14 d时平皿方法的克隆形成率(35.17％,13.17％)高于IncuCyte ZOOM 96孔全孔成像(23.13％,5.51％),且差异有统计学意义(P＜0.05);延长至21d时全孔成像的克隆形成率为(35.63％,13.22％),与平皿方法比较无统计学差异.结论 IncuCyte ZOOM系统能够简便、准确、省时省力地实现单克隆细胞筛选和克隆形成率检测.
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丹参含药血清对肝星状细胞增生的抑制作用
目的:研究丹参含药血清对肝星状细胞(HSC)的增生抑制作用,并探讨中药抗肝纤维化筛选平台的建立.方法:测定HSC-T6细胞的细胞生长曲线和克隆形成率,观察其细胞增生状况.取原始血清体积分数的80%,40%,20%,10%,5%的丹参含药血清作用于HSC-T6细胞,观察其增生抑制效应及量效关系.结果:HSC-T6细胞的细胞群体倍增时间为10.57 h,克隆形成率为82.4%,说明该转化细胞系的活力较好,增生能力较强.在5-80%浓度范围之内,丹参含药血清抑制HSC细胞增生作用呈剂量依赖性(经直线回归分析,相关系数r=0.9487).结论:丹参含药血清能明显抑制HSC-T6细胞增生,呈剂量依赖性.
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HepG2细胞在不同琼脂糖浓度下克隆形成能力的比较
目的: 探讨分离细胞克隆的佳细胞密度和适琼脂浓度, 为肿瘤干细胞的筛选提供更广阔的思路.方法: 将HepG2单细胞悬液与10 g/L的琼脂糖相混合, 在2 g/L(A组)和3 g/L(B组)琼脂中接种不同密度的HepG2细胞, 14 d后观察克隆形成.结果: 100-1000个/孔的各个实验组中, A组细胞的克隆数高于B组, 差异有统计学意义( t =4.36, P<0.05);在细胞密度为100-500个/孔时,A、B组细胞克隆形成率随着细胞密度的增加逐渐增加;600-1000个/孔, A、B组均随着细胞密度的逐渐加大, 克隆形成率呈现下降趋势.结论: 在进行软琼脂克隆形成实验时, 可以采用2 g/L的上层琼脂浓度, 并采用10 g/L的琼脂糖凝胶作为储备胶, HepG2细胞在500个/孔时的克隆形成率高.
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HCVNS3蛋白对正常人源肝细胞生长及MAPK磷酸化的影响
目的:研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对正常人源肝细胞的转化及MAPK磷酸化调节的作用.方法:利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达NS3蛋白的正常人源性肝细胞QSG7701,PCR和免疫组化S-P法检测细胞中NS3的表达;细胞记数和软琼脂实验鉴定其生物学性质;抗磷酸化MAPK抗体和抗MAPK抗体Westem blot检测转染细胞MAPK活性及表达.结果:HCV NS3转染的QSG7701肝细胞,其NS3蛋白过度表达于细胞质;真核表达质粒pRcHCNS3-5'转染细胞倍增时间为12 h,较pRcHCNS3-3'、pRcCMV转染细胞和未转染的QSG7701明显缩短(分别24 h,26 h和28 h).pRcHCNS3-5'、pRcHCNS3-3'和pRcCMV转染细胞及正常肝细胞在软琼脂中的克隆形成率分别为33%、1.33%、1.46%、1.11%,pRcHCNS3-5'形成的克隆明显高于其他三种细胞(P＜0.01).pRcHCNS3-5'转染细胞MAPK磷酸化程度明显高于其他三种细胞(分别为8 858±877,5 612±656,2 212±245和989±188).(P＜0.01),而MAPK的表达量没有差异(P＞0.05).结论:人源性正常肝细胞QSG7701是研究HCV NS3蛋白致病机制的较好的细胞系;HCV NS3蛋白N端多肽具有促进细胞增生和改变细胞表型的作用;HCV NS3蛋白N端多肽能上调MAPK活性,不影响MAPK的表达量.
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DPC4基因转染对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的:研究DPC4基因转染对结肠癌细胞生物学行为的影响,探讨DPC4在结肠癌的发生和发展中的作用.方法:利用基因重组技术构建PcDNA3.1-DPC4质粒;利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达Smad4蛋白的DPC4+-SW620(PcDNA3.1-DPC4转染的SW620高转移性结肠癌细胞株)细胞模型;采用免疫组化S-P法和Western blot检测细胞中Smad4的表达;生长曲线和平板克隆形成实验检测其生物学行为的改变采用流式细胞术检测其s期细胞百分数(s%)和凋亡率.结果:成功构建了PcDNA3.1-DPC4质粒;DPC4+-SW620细胞的Smad4蛋白表达于细胞质及细胞核,以细胞质为主,且smad4蛋白表达水平明显高于SW620细胞及PcDNA3.1-SW620细胞(PcDNA3.1转染的SW620细胞);DPC4+-SW620细胞的倍增时间为116h,较SW620细胞(31h,P<0.01)及PcDNA3.i-SW620细胞(29h,P<0.01)明显延长;DPC4+-SW620细胞的克隆形成率为(12%),明显低于SW620细胞(69%,P<0.01)及PcDNA3.1-SW620细胞(67%,P<0.01)的克隆形成率;与SW620细胞及PcDNA3.1-SW620细胞相比较,DPC4+-SW620细胞Go-G1期细胞百分数增多,s期细胞百分数明显减少(P<0.05);与SW620细胞及PcDNA3.1-SW620细胞相比较,DPC4+-SW620细胞的凋亡率较高.结论:成功地构建了质粒PcDNA3.1-DPC4,并转染SW620细胞株,得到稳定且表达Smad4蛋白明显增强的细胞模型;DPc4对结肠癌细胞增生的调控可能是通过DPc4抑制细胞生长和诱导细胞凋亡两方面作用实现的.
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子宫颈癌组织中热休克蛋白90α mRNA表达的研究
近年来,对热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)基因的生物学作用研究发现,其表达量的变化与肿瘤的发生关系密切.其中,HSP90α基因在不同病理分化程度的肿瘤组织和肿瘤细胞中呈选择性高表达[1].我们也曾经观察到HSP90基因在两株克隆形成率不同的子宫颈癌亚克隆细胞株中的表达有明显差异[2].为了探明HSP90α基因在人子宫颈癌发生、发展中的作用,我们用RT-PCR方法检测宫颈癌组织中HSP90α mRNA的表达.现将结果报道如下.
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应用凋亡和微核检测法预测细胞辐射敏感性的可行性研究
细胞辐射敏感性的预测一直是放射生物学和肿瘤治疗研究领域的重要内容，是肿瘤放射治疗方案尤其放疗个体化方案制定的关键。在动物实验和临床研究中，已提出了许多检测细胞内在放射敏感性的方法［1］。其中微核(MN)检测法是被广泛应用的方法之一［2，3］。但是人们仍对将其作为预测细胞辐射敏感性的可行性有争议。有作者报告，MN发生率与克隆形成率之间存在着内在联系，但也有报告认为并不存在这种相关性。影响这种相关性的因素一般认为有以下几个方面：细胞受照射时所处的细胞周期、双核细胞的百分比、DNA含量、细胞放射敏感性的不稳定性和照后凋亡细胞的发生［4，5］。细胞受照射后凋亡的形成率和细胞的辐射敏感性密切相关已有大量的报道。近有报道认为，一些因素引起的凋亡的发生与MN的形成之间有一定的相关性。并认为凋亡和MN的形成都是在第一次有丝分裂以后发生的，都和遗传物质受损有关。本研究采用3株人类细胞和两株啮齿动物细胞把辐照诱导的MN和凋亡与细胞存活率进行比较，对MN检测能否用来预测细胞放射敏感性的潜在可能性进行了评估。探讨了凋亡细胞对MN发生率的影响。 一、材料和方法 1.细胞和细胞培养：利用3株人体细胞和两株啮齿动物细胞：SHIN-3为人卵巢腺癌细胞株，DU-145为人体前列腺癌细胞株，COLO 320 DM为人结肠腺癌细胞株，CHO-K1为中国仓鼠卵细胞，F9细胞为鼠畸胎瘤细胞。将细胞在37℃条件下，含95%空气和5%CO2的潮湿环境中进行孵育。
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肝癌细胞辐射敏感性与G2期染色体畸变的线性关系及其应用研究
目的 研究人肝癌细胞系HepG2细胞辐射敏感性与G2期染色体断裂畸变关系及临床应用的可行性.方法 用Calyculin-A诱导的早熟染色体凝集技术测定细胞G2期染色体断裂畸变,用克隆形成实验测定细胞受照后的克隆形成率.结果 γ射线照射24 h后,G2期细胞内残存的等点染色单体断裂和染色单体型断裂与剂量之间存在良好的相关性;两类畸变与受照后的细胞存活分数均有一定的相关性,但等点染色单体断裂畸变的相关性(r为0.989)比染色单体型的(r为0.853)强.结论 细胞照后24 h,残存G2等点染色单体断裂畸变可以作为预测HepG2细胞内在辐射敏感性的指标,也可为临床诊断和治疗肝癌提供依据.
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一氧化氮对人肝癌细胞SMMC-7721辐射敏感性的增强效应
目的:观察一氧化氮对肿瘤细胞SMMC-7721辐射敏感性的作用效果.方法:实验于2005-06/09在兰州大学生命科学学院和中科院近代物理研究辐射医学实验室进行.处于对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721,在用X射线照射前4 h,换人含有0.1 mmol/L硝普钠(一氧化氮的前体)的培养液,与对照组(不加硝普钠)一起,在200 cGy/min的剂量率下,分别照射0,1,2,4,6,8 Gy,换为正常培养液培养.用集落形成法计算细胞的存活率,用吖啶橙/溴乙啶双染法检测细胞的死亡情况,用流式细胞仪检测细胞周期.结果:①存活曲线细胞存活率随照射剂量增加而减少,硝普钠组细胞的克隆形成率低于对照组(2 Gy时,P＜0.01).②细胞死亡百分率(坏死细胞与凋亡细胞总数/总细胞数):与照射剂量呈正相关,硝普钠组高于对照组(P＜0.05).对照组从(9.95±3.53)%(0 Gy)逐渐升至(58.74±3.46)%(6 Gy),而硝普钠组则从(18.53±12.02)%(0 Gy)迅速升至(61.57±9.53)%(2 Gy).③细胞周期检测结果:对照组细胞经过X射线照射后,出现了G2/M期阻滞[从0 Gy时(12.50±5.76)%逐渐增加到8 Gy(40.36±2.74)%],而硝普钠组细胞在低剂量时主要表现为G0/G1期阻滞[0 Gy:(16.06±7.19)%;2 Gy:(17.93±0.92)%],而G2/M期阻滞仅在高剂量时明显[8 Gy时为(50.10±3.93)%,P＜0.05].结论:经硝普钠产生的一氧化氮,通过与X射线协同作用,减少了肝癌细胞SMMC-7721的细胞存活率,促进细胞死亡,阻止细胞被阻滞至G2/M期,是一种有效的辐射增敏剂.
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转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞增殖和矿化能力的影响
背景：目前已有研究报道转化生长因子β超家族对各类干细胞成骨矿化的作用，但转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用仍有待研究。目的：观察转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞增殖和矿化能力的影响。方法：采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养，测定细胞集落克隆形成率，流式细胞术鉴定细胞表面标记物CD146，细胞爬片行Vimentin和STRO1免疫化学染色进行人乳牙牙髓干细胞鉴定；对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞给予肝素和质量浓度1，5，25μg/L的转化生长因子β3进行干预。MTS法测细胞生长曲线；茜素红染色；碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论：实验所得细胞集落克隆形成率高，细胞表面标记物 CD146呈阳性， Vimentin和STRO1免疫化学呈强阳性，鉴定获得人乳牙牙髓干细胞。MTS结果显示，给予转化生长因子β3刺激人乳牙牙髓干细胞后并无明显的促增殖的作用。碱性磷酸酶活性检测结果显示，转化生长因子β3-肝素联合作用可随着浓度的增加而增强人乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性，其中质量浓度分别为5，25μg/L 转化生长因子β3和肝素联合作用组与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比显著性升高(P<0.01)。转化生长因子β3-肝素联合作用组的茜素红染色均呈阳性，其中以5μg/L转化生长因子β3-肝素联合作用组染色强。结果证实，转化生长因子β3与肝素联合作用可促进人乳牙牙髓干细胞矿化能力。
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人生长激素释放激素受体剪接变异体1型对人肝癌细胞HepG2增殖的影响
目的:探讨人生长激素释放激素受体剪接变异体1型(GHRHR SV1)对肝癌细胞系HepG2增殖的影响,阐明GHRHR SV1对人肿瘤细胞的促增殖作用.方法:将GHRHR SV1真核表达载体导入HepG2细胞建立HepG2-SV1细胞系.设计对照组(野生型HepG2)、空载质粒组(HepG2-pCDNA 3.0细胞系)和干扰组(HepG2-SV1细胞系).采用P CR和Western blotting法鉴定HepG2-SV1细胞系,CCK-8法检测各组细胞的增殖率,克隆形成实验检测各组细胞的单克隆形成率,细胞划痕实验检测细胞的迁移率.结果:PCR与Western blotting法检测,构建的HepG2-SV1细胞系能稳定表达GHRHR SV1;CCK-8法检测,干扰组HepG2-SV1细胞系的增殖率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05);克隆形成实验,干扰组HepG2-SV1细胞系的单克隆形成率约为空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系的3.5倍(P<0.05);细胞划痕实验,所构建的干扰组HepG2-SV1细胞系的迁移率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05).结论:GHRHR SV1能促进HepG2细胞的增殖.
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玉屏风散对皮肤光老化成纤维细胞生长增殖的影响
目的:探讨益气固表代表方玉屏风散对皮肤光老化成纤维细胞生长增殖的影响.方法:采用血清药理学方法制备玉屏风散含药血清,紫外线照射建立细胞光老化模型,以不同浓度含药血清处理皮肤光老化成纤维细胞,观察细胞形态的变化,以MTT法测定细胞活力,以集落细胞形成能力实验测定细胞增殖能力.结果:紫外线能够显著损伤细胞形态,抑制其生长和增殖;玉屏风散含药血清具有抵抗紫外线对细胞损伤的作用,以服用8g·kg-1大鼠的含药血清作用24h效果佳.结论:玉屏风散含药血清能够缓解紫外线对成纤维细胞损伤,具有抗皮肤光老化的作用.
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瘢痕疙瘩成纤维细胞低密度培养的克隆能力分析
目的：比较瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）和正常真皮成纤维细胞（NFs）间克隆形成能力的差异，探讨瘢痕疙瘩中病理性干细胞是否存在，及其对瘢痕疙瘩发生发展的影响。方法利用酶消化法获得瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的原代细胞，以4000个/皿的密度接种，进行低密度培养，2周后观察细胞克隆的形成及形态变化。结果低密度培养条件下的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞都可形成克隆，但KFs可形成明显的克隆集落，NFs形成的克隆不明显且松散。KFs克隆形成率高于NFs，为（0.80±0.21）%，而NFs为（0.18±0.06）%，两者间差异显著（P<0.05）。结论低密度培养条件下，瘢痕疙瘩成纤维细胞的克隆形成能力高于正常皮肤成纤维细胞，可能与瘢痕疙瘩组织中存在病理性瘢痕疙瘩干细胞有关。
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DOC-2对卵巢癌细胞HO-8910致瘤力的影响
背景与目的:作为近年发现的新的肿瘤抑制基因,DOC-2的作用机制还不完全清楚.本实验的目的在于观察DOC-2转染后对卵巢癌细胞系HO-8910在克隆形成率、细胞周期、裸鼠致瘤能力等方面的影响,并对其作用机制进行初步探讨.方法:实验分3组:卵巢癌细胞系HO-8910(无DOC-2基因的表达)、8910-P93(经转染并表达DOC-2基因)、8910-pcDNA3.1(转染空载体pcDNA3.1),首先通过软琼脂克隆形成实验比较3组细胞克隆形成率的差异,之后利用流式细胞仪观察其细胞周期的变化,后用裸鼠荷瘤实验进一步验证DOC-2对肿瘤细胞致瘤能力的影响.结果:卵巢癌细胞系HO-8910在转染DOC-2后其克隆形成率明显降低,与转染前差异明显(P《0.05),同时G1和G2期细胞明显增多而S期细胞明显减少,移植瘤裸鼠荷瘤实验显示HO-8910-P93细胞在裸鼠体内生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显低于对照组(P《0.05).结论:DOC-2基因能明显抑制卵巢癌细胞系HO-8910的致瘤力.
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CD-TK双自杀基因系统对腺样囊性癌ACC-2细胞放疗增敏的作用
目的:探讨前体药物及CD-TK双自杀基因系统对人腺样囊性癌(ACC-2)细胞的放疗增敏作用.方法:重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK经电穿孔法共转染ACC-2细胞,以400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD及TK基因的ACC-2细胞,提取该细胞的总RNA,RT-PCR检测CD、TK基因的表达:将阳性克隆的ACC-2细胞分别在有氧及乏氧条件下给予不同剂量(0、2,4、6、8、10Gy)X线照射及前体药物干预,通过细胞克隆形成实验,观察双自杀基因及前体药物在有氧及乏氧条件下对ACG-2细胞的放疗增敏作用.采用SPSSll.5软件包对数据进行多因素方差分析.结果:RT-PCR检测到ACC-2/CD-TK中CD、TK基因的表达;随X线照射剂量的增加.各组细胞放疗后克隆形成率均明显降低;有氧条件下,X线照射ACC-2/CD-TK+前体药物组细胞存活分数均较相同剂量X线照射ACC-2及ACC-2/CD-TK细胞组低(P＜0.05);乏氧条件下.X线照射ACC-2/CD-TK+前体药物组细胞存活分数均较相同剂量X线照射ACC-2及ACG-2/CD-TK细胞组低(P＜0.05);相同照射剂量下,各相应细胞组在有氧条件下细胞存活分数较乏氧条件下低.结论:CD-TK双自杀基因及其前体药物的应用.可以提高ACC-2细胞放疗敏感性及X线放射治疗对ACC-2细胞的杀伤作用.
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表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究
目的 探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性.方法 (1)用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率.(2)将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果.(3)取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组:A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照.观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间.结果 体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组(P＜0.05).移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短(P＜0.05或P＜0.01).结论 以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗.
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人表皮细胞分离条件的优化
目的通过优化表皮细胞分离条件,大程度的获得基底层内的表皮细胞.方法采用Dispase Ⅱ酶与胰蛋白酶联合消化法分离培养表皮细胞.将Dispase Ⅱ酶浓度、胰蛋白酶浓度及其作用时间作为实验因素,利用L16(44)正交表设计实验,优化佳分离条件.观察不同分离条件对表皮细胞生长情况、贴壁率、克隆形成率的影响.正交设计的计量资料数据用方差分析.结果 Dispase Ⅱ酶、胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对原代分离的活细胞数无显著影响;胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对24h贴壁率有显著影响;胰蛋白酶作用时间显著影响克隆形成率.0.125% Dispase Ⅱ酶冷消化10h、0.1%胰蛋白酶37℃消化30 min,分离的原代表皮细胞克隆形成率高.结论通过优化表皮细胞分离条件,可大程度的得到有克隆形成能力的细胞,从而为利用表皮细胞作为人工皮肤的种子细胞奠定基础.
