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水通道蛋白1 在肺组织中的表达
肺泡腔和血管腔间水的快速转运有极其重要的生理功能。水的转运障碍将会使肺水稳态失衡，导致肺水肿等液体代谢紊乱性疾病。然而，肺泡毛细血管屏障转运水的机制尚不清楚。90年代初水通道蛋白（AQPs）的发现，使水代谢的研究有了一个飞跃。有关AQP1在肺组织的表达位置及数量，国内外研究尚无定论。本研究采用免疫组织化学技术及免疫电镜方法检测AQP1在肺组织中的表达，为探究肺水代谢机制提供实验及理论依据。 一、 材料与方法 1.肺组织标本留取：将30只体重为200～250 g SD大鼠(中国医科大学实验动物部)随机分成2组，每组15只，麻醉、放血后冲洗肺血管床。一组大鼠气管内灌流4％多聚甲醛并浸泡24 h以上，在每只大鼠左肺上叶取一小块肺组织及下段气管0.5 cm长。常规脱水、包埋制成蜡块，用于免疫组化染色。另一组大鼠气管内灌流0.5％戊二醛和2％多聚甲醛固定2 h，再浸泡于2％多聚甲醛中固定过夜，在每只大鼠左肺上叶取一小块肺组织，用于免疫电镜检查。
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髁突软骨的细胞分层及其功能研究
我们通过对髁突软骨细胞进行PCNA、FGFR3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体基因表达等研究,探讨髁突软骨的分层及其功能.1.材料和方法:成年日本大耳白兔共6只,雌雄各半.处死动物后,取TMJ标本, HE染色和免疫组化标本用多聚甲醛固定,EDTA脱钙,石蜡包埋.免疫组化采用超敏SP法.抗FGFR3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司(美国), 抗PCNA单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(购自福州迈新公司).基因序列、引物设计、RNA探针制备和原位杂交方法同以前的研究[1].
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糖心康对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响
1材料与方法主要试剂和药品:链尿佐菌素(STZ)为美国Sigma公司产品,糖心康(太子参、土鳖虫、枸杞子、丹参等)为黑龙江中医药大学附属第一医院药厂制作.原位末端标记检测试剂盒购自德国ROCHE-BM公司.有关芯片试剂及仪器设备,均为上海博星基因芯片公司制备.动物造模及分组:Wistar大鼠,雄性,体重200～230g,除空白对照组外,余者以25mg/kgSTZ左下腹腔注射,造模成功后,随机分为模型组和治疗组.各组均喂以高热量饲料.给药方法:治疗组以中药糖心康灌胃,空白组及模型组以生理盐水灌胃.标本采集:快速用-180℃、12h处理过的手术剪刀摘取心脏,立即用预冷的生理盐水冲洗,冲洗后在冰上操作,沿心室长轴切取心肌,部分置于2.5%戊二醛及4%多聚甲醛固定,供光、电镜观察使用.细胞凋亡检测:TUNEL法检测心肌细胞凋亡.具体步骤按试剂盒使用说明操作.阳性制定标准:以细胞核被染成棕褐色为阳性结果.②电镜超微形态学检测心肌凋亡,其特征是:细胞核染色质密度高并边集,核固缩畸变,核膜内陷,可见凋亡小体.
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介绍一种神经组织的快速展片方法
组织制片需很多环节才能完成,在大量制片时,其中的任何一个环节速度过慢都会影响到整个制片的进程.而神经组织因其含有大量的类脂,具有嫌水性,它的温水展片速度很慢,尤其是经甲醛或多聚甲醛固定的组织,由于经酒精脱水后组织收缩严重,在35～40℃的温水中平均需要约5～7min才能展平.为了加快速度,我们曾经用提高水温的方法,但水温超过40℃后,组织蜡片很快分散,组织展平的速度虽然加快了,但由于组织间隙的存在,组织也会随蜡片的分散而分离.为了解决这一难题,我们经过多次实验,终于找到了一种行之有效的方法,现介绍如下.
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静压力对体外培养动脉中层血管平滑肌细胞的影响
为探讨压力在血管重建中的作用,观察了不同静压力条件下,体外培养动脉中层平滑肌细胞的形态学变化、增殖与凋亡及其相关蛋白的变化趋向.本文选用成年雄性金华猪颈总动脉4～7cm,在不同静压力(160mmHg、100mmHg)下培养1、4、7天(控制血管内流体流量≤6ml/h)后,4%多聚甲醛固定,以新鲜血管为对照组,血管常规石蜡切片后,应用HE染色、免疫组织化学、TUNEL、Hoechst33258荧光染色、透射电镜等方法进行观察.
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流式细胞仪同时检测实体肿瘤P53蛋白和DNA含量
目的:建立流式细胞仪检测方法,研究P53抑癌基因蛋白与DNA的关系.方法:71例肿瘤手术样本,其中良性8例,恶性63例.①用机械方法获得实体肿瘤组织的单细胞悬液,1%多聚甲醛固定,或50%-95%乙醇固定,0.1%tritonX-100处理.先P53-FITC核抗原标记,再溴化丙啶(PI)染DNA,流式细胞仪双参数分析.②相同样本32例P53蛋白免疫组化ABC法检测.结果:1%多聚甲醛固定方法优于酒精固定法.流式细胞仪分析结果与免疫组化一致(Kappa＞0.04).P53过量表达与DNA倍体相关(P＜0.005).结论:流式细胞仪双参数检测DNA含量和癌基因蛋白是一个快速,直观的好方法.
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一氧化氮合酶在寻常型银屑病皮损中的表达
一氧化氮(NO）是组织内的一种信号分子，具有多方面的生理和病理活性，它由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS）催化L-精氨酸生成，银屑病患者血浆[1]和皮损局部[2]产生NO水平比正常人显著升高，且诱生型一氧化氮合酶（inducible NOS,iNOS）在寻常型银屑病患者皮损中表达增强[3]。我们对20例寻常型银屑病患者皮损神经型一氧化氮合酶（neuronalNOS,nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（endothelialNOS,eNOS）和iNOS的表达进行了免疫组化检测。一、材料与方法1.病例：20例寻常型银屑病患者，病程3个月至27年不等，取材时均为进行期，且至少2个月内未经系统治疗（包括紫外线照射治疗），切取2～4周新生典型皮损。10例正常皮肤取自美容外科。组织块经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色经病理证实。
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癫痫大鼠边缘系统神经元凋亡研究
颞叶癫痫是症状性癫痫中常见者，与其解剖和病理密切相关的大脑边缘系统一直是癫痫研究者关注的重点。海人藻酸（KA）是谷氨酸结构类似物，脑内或系统给予，可选择性激活边缘系统诱发癫痫（EP）发作，由于其致痫后癫痫发作行为和病理学改变与人类颞叶癫痫的相似性，被广泛接受作为人类颞叶癫痫的急性模型。证据表明，持续癫痫后的神经元损伤存在细胞凋亡的过程，但多数报道局限于海马区。实际上痫性抽搐所致脑组织损伤累及皮层及边缘系统的大部分脑区。本研究用TUNEL标记技术观察实验性癫痫鼠边缘系统敏感脑区细胞凋亡的分布和时程变化。材料与方法 雄性Wistar成年大鼠28只，分KA致痫组20只，对照组8只。 一、动物模型制备：大鼠乙醚麻醉置于立体定位仪，致痫组于双侧脑室分别注入0.5μl（含0.3μg）KA以制造癫痫模型。KA注射后10min癫痫发作，持续3h停止。分别于术后6h、1d、3d、7d各处死5只，快速取脑，－20℃储存备用。对照组双侧脑室注入等量生理盐水（NS），于上述相同时程各处死2只，取脑。 二、TUNEL原位末端标记：脑行冠状冰冻切片，片厚14μm，取背侧海马、杏仁体、背侧丘脑、下丘脑、梨状皮层为观察部位。凋亡细胞原位末端标记试剂盒购于Roche公司。切片用4％多聚甲醛固定1h后，参照手册步骤进行凋亡细胞染色标记，DAB显色，HE复染后封片镜检。 三、结果分析和统计处理：每只大鼠取同一观察部位切片四张（间隔60μm），用40X显微镜计数每一时程观察脑区单位平方毫米mm２阳性细胞数，并平均之作为本时程组鼠切片中阳性细胞数。实验数据以均数±标准差（±s，n／mm２）表示，用SPSS统计软件包对实验数据进行One-Way Anova分析。结果 一、行为学观察：侧脑室注射KA 10min后均出现癫痫发作，持续3h停止。根据Racine癫痫行为分级，KA注射组动物达到四级或五级，符合癫痫模型要求。 二、光镜结果：TUNEL阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色，核固缩呈圆形或不规则形；高倍镜下可见染色质深染聚集成块或碎裂，核边聚等，符合凋亡细胞形态变化。在注射NS组中，未见凋亡细胞的形态学改变。KA致痫组凋亡细胞在边缘系统分布与时程变化见表1。
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八肽胆囊收缩素逆转内毒素休克大鼠心功能衰竭及机制研究
目的:观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)改善内毒素休克(ES)大鼠心功能的影响, 探讨CCK-8逆转ES的作用及机制.方法:实验分4组.(1)对照组,静脉注射生理盐水0.2 mL;(2)LPS组,静脉注射8 mg*kg-1 LPS;(3)CCK组,静脉注射 40 μg*kg-1 CCK-8;(4)CCK+LPS组,静脉注射40 μg*kg-1 CCK-8,10 m in后再注入LPS(8 mg*kg-1).右颈总动脉插管测定左室内压峰值(LVP)及心率(HR),左室收缩与舒张期内压变化的大速率(±LVdp/dtmax ),股动脉插管监测平均动脉压(MAP),尾静脉穿刺注射药物.取左室心肌组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色,光学显微镜下观察.结果:单独静脉注射CCK-8,计数HR5 min显著下降为(340±15)次/min,10 min后恢复正常(381±22) 次/min;测量MAP、LVP 和±LVdp/dtmax在30 s后开始增加,3-5 min达到高峰为(16.58±1.07) kPa, (18 .73±0.50) kPa和(+723.52±55.95)/(-507.05±30.24) kPa, 持续约15 min恢复正常 (14.20±1.38) kPa, (17.07±1.62) kPa和(+641.38±32.88)/(-419.67±46.41) kPa.静脉注射LPS后5 min HR明显增加(395±12)次/min ,10 min后基本恢复,而在20 min是迅速下降至低水平(313±18)次/ min, 30 min后有所回升 , 至2 h稳定于稍低水平; MAP, LVP和±LVdp/dtmax较对照组快速持续下降, 2 h时下降为(7.16±0.59) kPa、(7.60±0.68) kPa和(+298.01±25.52)/(-166.96±19.25 ) kPa; CCK+LPS组 HR在10-20 min是轻度增加, 30 min后HR恢复正常,30 min内MAP、LVP和±LVdp/dtmax下降幅度与LPS组无显著差异,30 min后即迅速回升,至120 min仍维持在较高水平(10.71±0.45) kPa, (11.70±1 .26) kPa和(+446.04±67.18)/(-347.90±136.98) kPa (P＜0.01).心脏组织形态学变化:CC K-8可明显减轻心肌组织炎性细胞浸润和毛细血管血液瘀积.讨论:整体预先注射CCK-8(40 μg*kg-1)可明显缓解心率的快速变化,逆转ES大鼠MAP、LVP、+LVdp/dtmax下降,其作用机制可能与以下因素有关:(1)心肌细胞保护作用.(2)CCK-8可对抗ES大鼠的阿片肽心血管抑制效应.(3 )CCK-8可能直接作用于心肌细胞,逆转LPS所致胞浆内钙离子浓度降低,恢复心肌细胞收缩力.结论:单独静脉注射CCK-8可短时间内引起心动过缓,MAP上升和心肌收缩力增强;预先注射CCK-8可以明显缓解心率的快速变化,逆转ES大鼠心功能衰竭及顽固性低血压,是其发挥抗ES的主要机制.
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LPS对人脐静脉内皮细胞的F-actin和VE-cadherin细胞定位和结构的影响
目 的:应用免疫荧光技术,通过观察人脐静脉内皮细胞株ECV304的F-actin和VE-ca dherin的细胞定位和结构变化,从形态学的角度阐述LPS对内皮细胞的直接作用.方法:将EVC304细胞以1×108/L接种在微孔小皿上,培养至单层铺满皿底开始实验.对VE-cadherin的观察分为正常组、VE-cadherin一抗阴性对照组和LPS l00、200、300、400、500 μg/L刺激组 .LPS各组先用不同浓度的LPS直接刺激细胞30 min,PBS洗3次,2%多聚甲醛固定20 min, 加一抗(Goatpolyclonal l∶100)4℃2 h,而后加VE-cadherin荧光二抗(Rabbit-Anti-Goat-FITC l∶200)4℃ 1 h,PBS洗3次共10 min(避光);对F-actin观察组,先用2%的多聚甲醛、0. 5 %TritonX-100混合PBS液固定和膜打孔20 min、洗涤,罗丹明-鬼笔环肽(2×103 U/ L)染色40 min,P BS洗3次,后用NikonTE300荧光倒置显微镜镜检,Kodak 200胶卷照相.结果:[ HTSS〗1.VE-cadherin的变化:正常组可见内皮细胞间紧密连接处染色轮廓清晰,可见膜内侧有较弱的染色, 胞浆无染色;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对VE-cadherln的细胞分布没有明显影响;300 、400、500 μg/L LPS组可看到细胞间紧密连接处染色明显减少,部分视野细胞回缩,有明显的细胞间隙形成,膜内侧有较强的染色;一抗阴性对照组没有染色.2.F-actin的变化:正常组F-actin主要分布在细胞的周边,分布均匀、排列整齐,细胞间连接紧密,没有间隙形成;低浓度的LPS(100、200 μg/L)对F-actin的分布及重组没有明显影响;高浓度的LPS(3 00、400、500 μg/L)刺激后,内皮细胞周边的F-actin基本消失,出现明显的应力纤维(变粗、变短、紊乱,排列呈明显的极向分布),可见伪足,并伴随细胞间缝隙形成.讨论: LPS(脂多糖)是内毒素的活性成分,作用于细胞的机制很复杂,此前众多学者对LPS作用于细胞的信号转导通路做了大量的研究,但是对于LPS直接对内皮细胞刺激的情况下,真正从形态学的角度着手的很少.本实验从形态学入手,结果表明,LPS在体外高浓度的(大于300 μg/L) 直接刺激下,引起骨架蛋白的重组和细胞内的重新分布,具体表现为F-actin排列紊乱,可见伪足,进而细胞间隙形成:VE-cadherin染色部分缺失是细胞间隙形成的直接证据.结论 :高浓度的LPS(大于300 μg/L)通过某种途径直接作用于内皮细胞,可影响F-actin和VE-c adherin的重组和细胞内分布.
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羟基喜树碱对兔晶体上皮细胞的抑制作用
目的:为研究羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine,HCPT)对体外培养的兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长的影响,探索预防后发性白内障的药物.方法:2～3月龄健康家兔20只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;96孔酶标板;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,置入CO2孵箱中培养24 h后,将不同浓度的HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的抑制作用;(2)将传代的RLECs接种于96孔板中,立即加入HCPT(浓度为小于半效抑制量的1/10,因该浓度对细胞无杀伤作用)24 h后取出,加入MTT在酶标仪上比色;(3)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的HCPT,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(4)将浓度为1.34 μg/mL的HCPT作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,离心弃上清液,戊二醛固定,电镜观察超微结构的变化(另设未加药组为对照).结果:HCPT能有效抑制体外培养的RLECs的增殖.24 h的半效抑制量(ID50)为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.340 μg/mL;且HCPT对RLECs贴壁有影响,使部分RLECs不能贴壁.光镜下可见HCPT主要引起细胞核固缩、碎裂等病理变化,其胞浆的改变表现为空泡及深染的粗颗粒.电镜下见经HCPT处理的RLECs线粒体肿胀,可见典型的凋亡细胞及凋落小体的形成.结论:HCPT是一种新型的抗癌药,其作用靶是拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ).其低剂量、长时间作用于RLECs,抑制效果明显,该药不仅抑制细胞增殖,还影响细胞贴壁.因此是一种有潜力的预防后发性白内障的侯选药物.
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紫杉醇诱导兔晶体上皮细胞凋亡的实验研究
目的:从诱导兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)凋亡的角度观察紫杉醇(Taxol)对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2～3月龄家兔40只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;TUNEL试剂;24孔酶标板;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2～3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放进CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将传代RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(3)将一定浓度的Taxol作用于2～3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,戊二醛固定,行超微结构观察(同时设未加药标本为正常对照).(4)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h,固定后行TUNEL染色并在光镜下观察(另将未加药标本为阴性对照.).结果:本研究发现Taxol对体外培养的RLECs有抑制作用,其24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.光镜下,正常对照的RLECs呈多边形上皮样,胞浆丰富、粉红色、胞核呈紫蓝色.部分用药组细胞体积缩小、呈圆形、包浆浓染,可见染色质边集、胞核固缩、碎裂等多种形态改变.电镜下观察用药组细胞见典型的凋亡细胞及凋亡小体的形成.TUNEL染色见部分用药组细胞胞核呈深棕黄色,提示细胞凋亡.结论:本研究通过光镜、电镜以及免疫组化等多方面的证实:Taxol主要是通过诱发细胞凋亡的机制而抑制RLECs生长的.
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慢性缺氧对肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA表达的影响
目的:世居高原的人、动物或肺动脉高压的大鼠,常出现HPV钝化现象,即急性缺氧时肺血管收缩反应下降.这有助于防止肺动脉高压进一步升高及高原性心脏病的发生,有一定的代偿意义.由于NO是一种重要的血管舒张因子,那么慢性缺氧后肺血管对急性缺氧的收缩反应减弱是否与NO的调节作用增强有关呢?为验证这个推测,本实验动态观察了连代缺氧培养的肺动脉内皮细胞在急性缺氧时NOS Ⅲ mRNA表达的变化.方法:采用胰蛋白酶消化法培养猪肺动脉内皮细胞,分别在常氧(PO2 21.3 kPa)和缺氧(PO2 5.3±0.7 kPa)条件下培养并传代,在2、4、6代给予急性缺氧刺激12 h,分为常氧组(N)、急性缺氧12 h组(NH)、慢性缺氧后复氧12 h组(H)、慢性缺氧后复氧12 h再急性缺氧12 h组(HH).4%多聚甲醛固定后,用针对人或鼠NOS Ⅲ cDNA的多相寡核苷酸探针进行原位杂交.结合图像分析,半定量检测NOS Ⅲ mRNA的表达.结果:在2、4、6代,常氧培养的肺动脉内皮细胞急性缺氧12 h,NOS Ⅲ mRNA表达明显增加(分别比缺氧前增加48%、125%、119%, P＜0.05);从第4代起,慢性缺氧组eNOS mRNA在复氧12 h后仍高于常氧组(P＜0.01);慢性缺氧培养的肺动脉内皮细胞复氧后再急性缺氧12 h,eNOS mRNA表达亦明显增加(分别比缺氧前增加92%、245%、565%,P＜0.01),其增加的幅度,在HH组均大于同代NH组,随缺氧时间的延长更为显著.结论:慢性缺氧增强了急性缺氧时肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA的表达,NO调节作用增强,可能是慢性缺氧所致HPV钝化的一个因素.
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中性粒细胞抑制人单个核细胞释放TNF-α及其机制的研究
目的:探讨人中性粒细胞(PMNs)对人外周血单个核细胞(PBMCs)释放TNF-α的影响及其作用的初步机理.方法:采集健康供血者的新鲜外周静脉血,以葡聚糖沉淀和密度梯度离心法分离其PMNs和PBMCs,将PMNs与PBMCs按2∶1的数量比与脂多糖共同培育后,分别采用酶联免疫吸附法测定培养上清的TNF-α浓度,并用流式细胞测定结合荧光标记脂多糖的单核细胞的百分率及单核细胞表面平均荧光强度.结果:PMNs在细菌脂多糖刺激下不释放TNF-α,PMNs可以抑制PBMCs释放TNF-α,其抑制作用具有细胞特异性;经多聚甲醛固定的PMNs仍具有上述的抑制作用.流式细胞仪结果显示PMNs并不影响单核细胞与脂多糖结合.结论:PMNs可抑制人PBMCs释放TNF-α,其机理可能是PMNs干扰了脂多糖激活PBMCs的信号转导过程,抑制细菌脂多糖对其的活化,从而下调TNF-α的释放.
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改良溃变神经纤维镀染方法经验介绍
对于溃变神经纤维的镀染,Nute法是较可靠的形态学方法之一,但存在着程度较为复杂、烦锁等问题.为此我神经切片研究室在实际应用中,对于一些实验步骤,大胆地进行了改良和简化,结果与改良前相比没有显著差异,但操作过程却比原方法简便、易行、结果稳定 ,使实验者的工作量明显下降.现将改良的关键处介绍如下:一、固定:原方法:灌注固定先灌0.9%生理盐水冲出血液,再以5%重铬酸钾和2.5%铬酸钾的水溶液500ml灌注固定.取出组织固定于10%中性福尔马林1w或更长至3m.改良后,我们增加了取材后组织再浸泡于灌流液中2～4hr这一步骤,它可防止灌流时灌流液不能完全达到周缘神经组织部位,同时缩短了组织后固定的时间,只将组织再浸入4% 多聚甲醛固定1～7d即可.二、包埋和切片:原方法:取5～10mm厚的组织流水冲洗24hr,放入装有25%明胶水溶液的培养皿中(加盖),于37℃温箱浸泡12～18hr进行明胶包埋,置于10%福尔马林中6 hr或更长.改良后我们在切片前增加了将组织浸入10%或20%的蔗糖液中过夜这一步骤,次日再将组织骤冷,在恒冷箱中切片,并且将切片置于0.05M磷酸缓冲液,贴至挂过明胶的载玻片上行染色操作.这样我们省略了明胶包埋这一复杂程序,使实验单位易行.三、封固:原法是将切片浸入10%明胶水溶液与等量95%酒精中5min,切片摊于载玻片上,使载片倾倾斜倒出多余水,勿使切片完全干燥,再用95%酒精,浸泡吸水纸压平浸入95% 酒精使明胶凝固、脱水、透明封片.改良后我们在染色后将片直接用梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,树胶封固,可省去明胶贴片、压片、凝固等步骤.
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人眼角、巩膜发育的计算机辅助定量研究
传统观点认为,成人眼角、巩膜比例为1∶6.周国民等于1986年报道正常成人的角、巩膜面积比应为1∶12. 我们采用角、巩膜铺片结合计算机图像分析,对胚胎发育过程中眼球的角、巩膜面积进行测量,并计算二者的比例,以期进一步探讨眼球发育的一些基本规律.材料与方法:人工流产及引产的人胚胎眼球标本36例,胎龄6周至36周,4%多聚甲醛固定4 小时.体视显微镜下沿示道将眼球切开,分别以眼球前后极为中心将前、后两半球作放射状切片,并平铺在载玻片上.体视数码摄影系统将前后两半球图像输入计算机,在NIH I mage 1.62中存为TIF格式,分别选取眼球前、后半图像作面积测量.结果:第8周以前,角膜面积和巩膜面积分别在4mm2与36mm2以下.第12周, 二者面积分别增至6mm2和60mm2.至第14周,分别猛增至16mm2和135mm 2.以后增长迅速,第16周时,角、巩膜面积分别为22mm2和185mm2,第21周则为30mm2和300mm2左右.至出生前,角、巩膜面积分别达70mm2和700mm 2.角膜占眼球表面积的比例,在18周以前,接近1/10;18周以后至出生前,一直较恒定地维持在1/11.讨论:利用计算机图像处理系统,研究人胚胎发育中眼球各部分面积的变化,在国内外尚未见报道.研究发现,在人胚胎第14周以前,角膜和巩膜的发育缓慢,14周以后增长非常迅速.提示在该阶段可能有相关基因的激活与表达.这些基因的表达还可能进一步影响到眼球的大小与形状.同时,在此阶段,视网膜的各层逐渐形成,节细胞层出现并与脑发生联系, 对眼球角、巩膜的发育可能会有某种调控作用.此外,自第8周始,上下眼睑关闭,给眼球的发育提供了一个相对独立的环境,也可能对这种迅速增长起一定作用.我们还用相同的方法测得正常成人、牛、狗和小鼠的角、巩膜面积比分别为1/17、1/6、1/9.5和 1/3.有意思的是,在胚胎发育过程中角、巩膜的比例变化较小,而出生以后变化则较快 .因此在出生以后眼球的发育仍有相当大的可塑性.不同种属间角、巩膜比例的差异,也值得我们进一步研究.
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多聚甲醛固定对流式细胞术检测抗原表达的影响
目的 以小鼠脾脏淋巴细胞为例,探讨科研工作中多聚甲醛固定时间对流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞亚群百分比及平均荧光强度的影响,为科研中准确检测表面抗原提供依据.方法 获取小鼠脾脏淋巴细胞,分别以CD3-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD4-藻红蛋白(PE)标记淋巴细胞,样本制备完成后用2%多聚甲醛固定,利用流式细胞术检测CD3+、CD4+细胞的百分比及平均荧光强度,并分别在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h记录数据,比较以上时间点CD3+、CD4+细胞的百分比及平均荧光强度是否有差异.结果 样本经2%多聚甲醛固定后,CD3+、CD4+细胞的百分比及平均荧光强度与样本制备完成立即上机检测相比均逐渐降低,其中24 h之后各个时间点CD3+、CD4+细胞的平均荧光强度与0 h相比,具有明显的差异,具有统计学意义(P<0.05);但CD3+、CD4+细胞的百分比均无明显变化,不具有统计学意义(P>0.05).结论 细胞群体中抗原表达百分比受固定时间影响较小,尤其是高表达抗原如CD3、CD4等分子;抗原表达的平均荧光强度更易受固定时间的影响.样本制备完成后,尽早上机检测,是获取准确数据的优选择,不能立即上机检测的应使用2%多聚甲醛固定后4℃保存24 h内上机检测,仍然可以得到较为真实可靠的数据.对于需要多时间点收集的强抗原检测,可以考虑制样后1w内检测,其阳性细胞表达率仍然可信.
