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Ro60/SSA基因转染HEp-2细胞作为间接免疫荧光检测底物及其应用
本研究拟改造间接免疫荧光技术(IIF)抗核抗体(ANA)检测法的底物HEp-2细胞,建立抗60kDRo60/SSA抗体免疫荧光检测法.采用PCR扩增人源Ro60 cDNA,克隆入真核表达载体pEGFP-C1,并转染HEp-2细胞.通过荧光显微镜、免疫印迹法(IBT)及IIF鉴定转染细胞(HEp-Ro60)中Ro60-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达和抗原性.分别以HEp-Ro60以及HEp-2为底物的IIF检测10份抗Ro/SSA对流免疫电泳(CIE)检测阳性、其他抗体阴性血清以及对照血清.获得的转染细胞传十几代后仍具有较强的Ro60-GFP表达,融合蛋白保持Ro60的抗原性.IIF检测中HEp-Ro60的滴度比HEp-2增加了6.7倍(P＜0.01),而且2例HEp-2细胞上IIF检测为阴性的血清在HEp-Ro60上为阳性.10例阳性血清中有8例出现了特征性荧光模式.结论是HEp-Ro60可用于IIF检测抗Ro抗体,并增加了ANA检出的敏感性.
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体外培养状态下心肌细胞有丝分裂的证据
目的 探讨体外培养状态下心肌细胞有丝分裂、增殖的证据.方法 分离新生大鼠心肌细胞,分别原代培养0h至12d;免疫荧光分别双标心肌肌钙蛋白-T(cTnT)、磷酸化组蛋白H3(H3P)和微管蛋白(tubulin),利用活细胞工作站和荧光显微镜观察处于分裂期的心肌细胞.结果 原代培养的心肌细胞生长状态好、纯度高,可观察到分裂各期的心肌细胞及其微管蛋白的变化.处于分裂各期的心肌细胞不隆起变圆仍维持扁平状.分裂前期细胞核形状规则,染色质凝集,H3P开始表达;前中期核膜破裂,纺锤体形成;中期染色体排列在赤道面,纺锤体呈典型纺锤样;后期染色单体分开并移向两极;末期子核形成,平行微管聚结在两子核之间;胞质分裂期形成两个子细胞,两个细胞分开后,可见有少量微管呈丝状连接.原代培养1 ～12d的心肌细胞在整个细胞分裂图像中很少见到双核心肌细胞.培养第3天开始发现分裂象的心肌细胞,占总心肌细胞数的2/127(1.57％)和1/92(1.09％),培养第7天,分裂细胞比率达3/69(4.35％)和5/163(3.07％),培养第12天有2/100(2％)和0/60(0)的心肌细胞处于分裂期.结论 体外培养的心肌细胞存在一定数量的完全有丝分裂,是心肌增殖和心肌再生的细胞学证据.
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转化生长因子-β1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究
目的 添加转化生长因子-β1(TGF-β1)以及与内脏内胚层样END-2细胞共培养,定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化,探索联合使用化学诱导法与共培养法对ESCs的心肌细胞定向诱导分化作用.方法 将ESCs悬浮培养形成2～3 d类胚体(EBs),再向培养液内添加TGF-β1,或(和)将2～3 d EBs与END-2细胞或END-2细胞条件培养液共培养.自然分化为对照组.免疫荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(α-actin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构.结果 向培养液添加TGF-β1或将2～3 d EBs与END-2细胞或END-2细胞条件培养液共培养,各自有(43±2.08)%(P＜0.01),(69±3.61)%(P＜0.01),(65±3.06)%(P＜0.01)的EBs出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白α-Actin和TnT,观察到心肌样超微结构.自然分化组发生自发节律性收缩的EBs只有(12±1.53)%,尤其是联合使用两种诱导方法,自发性收缩的EBs高达(91±1.52)%(P＜0.01),收缩区域较单一诱导组大,且细胞形态较单一.结论 联合使用化学诱导和共培养2种诱导法对ESCs的心肌细胞定向分化有协同作用.
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免疫荧光技术检测室内感染蚊虫体内登革病毒的研究
目的探讨检测媒介蚊虫体内登革病毒的方法. 方法以埃及伊蚊和白纹伊蚊两种有效媒介为研究对象,在人工经口感染大剂量登革2型病毒(DEN-2)的基础上,通过蚊细胞培养病毒分离和蚊头部压片免疫荧光技术进行病毒抗原检测. 结果埃及伊蚊感染DEN-2病毒1 d后,接种C6/36细胞,盲传一代后第5 d出现空斑现象,确证细胞发病.白纹伊蚊经口感染登革病毒后,取吸血雌蚊每日进行头部压片免疫荧光检测,结果显示,从蚊虫感染后第1 d～第20 d内均能检测到病毒抗原. 结论用免疫荧光技术,可直接检测出感染蚊体内是否携带登革病毒,是较为简便、省时、敏感的方法.
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甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析
目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达.方法 根据Genbank(NCBI ISDN13425)中查得的M2e编码序列,设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端,退火后使之互补结合成为M2e编码序列;然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e;经酶切和DNA测序鉴定后,转染HEK293细胞,用免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-M2e在HEK293细胞的表达,并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况.结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链,插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3.1(+)-M2e.免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上,转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖,表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外.结论 成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e,表达的M2e蛋白不仅存在于细胞膜上,也可分泌到细胞外.流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础.
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血管组织自发荧光的去除方法及应用
血管组织尤其是动脉(如主动脉、颈总动脉、肾动脉等)具有丰富的弹性纤维与胶原纤维,后两者有很强的自发荧光,在荧光显微镜下根本不能区分特异荧光与组织自身的自发荧光,显著干扰荧光染色结果的观察,这限制了免疫荧光技术、绿色荧光蛋白((WP)等荧光报告基因载体在心血管组织的应用[1].
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免疫荧光和激光共聚焦显微镜对人横纹肌肉瘤细胞系的观察
细胞质内骨架包括微丝、微管及中间丝.现今可采用多种技术如各种电镜技术、免疫荧光技术、流式细胞术来研究细胞骨架在细胞生命活动中的作用.近年来发展起来的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)可以显示细胞骨架的结构及分布,并能进行定量分析.我们采用直接与间接免疫荧光法,运用LSCM观察细胞骨架,比较人体的横纹肌肉瘤细胞系与培养的正常人横纹肌母细胞的差别.
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三种方法检测抗dsDNA抗体的比较
目的 比较间接免疫荧光法(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)及放射免疫检测法(Farr)检测抗dsDNA抗体的敏感性及特异性,为开展临床联合检测寻找合适的方法.方法 收集我院门诊和住院患者血标本共200份,其中包括门诊和住院及后期追踪经临床诊断的系统性红斑狼疮(SLE)120份标本、类风湿关节炎(RA)20份标本.进行性系统硬化症(PSS)20例.混合型结缔组织病(MCTD)20例,干燥综合征(SS)20例,另健康体检者50例(全部经排查不具有结缔组织病)同时用以上三种方法检测抗dsDNA抗体.结果 用IIF、ELISA及Farr检测抗dsDNA抗体,SLE患者抗dsDNA抗体阳性率分别为25%、32%和32%.RA患者抗dsDNA抗体阳性率均为0.PSS患者抗dsDNA抗体阳性率分别为0.0和5%.MCTD病抗dsDNA抗体阳性率分别为0、5%和10%.SS患者抗dsDNA抗体阳性率均为0.健康体检者抗dsDNA抗体阳性率均为0.结论 用两种方法联合检测抗dsDNA抗体,尤其是IIF和ELISA检测,能提高单一一种方法对SLE患者抗dsDNA抗体检出率,有助于SLE的诊断及病情回顾.
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免疫组化技术诊断肾综合征出血热病毒的研究
肾综合征出血热病毒(hemorrhagic fever with renal syndrome virus,HFRSV)在我国广泛流行,其发病率和病死率均高,对人群的生命健康造成严重危害.目前,特异性诊断方法多为ELISA和免疫荧光技术,现在广泛应用尚存在一定难度,采用高效价优质抗原片进行酶免疫组化法检测,能早期快速诊断,方法简便易行,敏感性高,特异性强.
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小干扰RNA抑制胃癌细胞株葡萄糖调节蛋白Grp78的表达
目的:观察Grp78靶向RNA干扰质粒载体对人类胃癌细胞株7901 Grp78基因表达的抑制作用.方法:设计1对Grp78基因发卡寡核苷酸,并与psiSTRIKETM质粒载体连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体,将重组质粒导入人类胃癌细胞株7901内,分别在转染前、转染后24,48和72 h通过RT-PCR、免疫荧光技术检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况.结果:成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78干扰质粒载体命名为p siSTRIKETM/Grp78.将上述质粒转染到人类胃癌细胞株后,观察到Grp78 mRNA及蛋白水平的表达明显下调,随着时间的延长Grp78在实验组中的表达逐渐降低,并随着时间推移稳定存在.阴性对照组,转染前组,转染12,48,72 h组Grp78的mRNA相对表达量分别为1.069,0.972,0.662,0.408,0.420.转染后组较转染前组及阴性对照组分别具有显著性差异(P＜0.01),转染前与阴性对照组无显著性差异(P＞0.05).转染前后组免疫荧光表达结果统计学差异明显(P＜0.001),其中转染后48 h同转染后24 h相比较Grp78蛋白表达明显减少(P＜0.00714).结论:构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达.
关键词： 胃癌 RNA干扰 葡萄糖调节蛋白 逆转录-聚合酶链反应 免疫荧光技术 -
严重急性呼吸综合征患者细胞因子与趋化因子表达谱的特征
由于严重急性呼吸综合征(SARS)的免疫病理机制尚未阐明,目前尚无有效药物或治疗方法能够控制这种疾病.为了探讨SARS发病的免疫学机制,我们研究了SARS患者外周血细胞因子与趋化因子的表达谱以及肺和淋巴组织的免疫病理改变.采用液相芯片技术,动态扫描了23例诊断明确的SARS患者血中14种细胞因子与趋化因子;应用反转录PCR、免疫组化和免疫荧光技术对SARS死亡患者经尸体解剖的肺和淋巴组织进行免疫病理学观察.
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婴幼儿血管瘤组织中β2受体的表达
目的 探讨β2受体在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其在血管瘤病理演变过程中的作用.方法 将48例婴幼儿血管瘤患者分为增殖期组(29例)和消退期组(19例).采用免疫荧光技术将两组婴幼儿血管瘤组织进行荧光标记.观察两组照片荧光标志物的显示位置,并应用Image-Pro Plus 6.0软件分析比较内皮细胞核及β2受体阳性的平均荧光强度.结果 荧光显示,β2受体于婴幼儿血管瘤中广泛表达,并以内皮细胞核荧光表达处为主.增殖期组内皮细胞核的平均荧光强度0.031±0.002显著高于消退期的0.022±0.002,差异有统计学意义(P＜0.05).增殖期组β2受体的平均荧光强度0.035±0.003显著高于消退期组的0.028±0.002,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 β2受体主要广泛表达于婴幼儿血管瘤内皮细胞.
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EB病毒两种实验室检测方法对比分析
目的 比较EB病毒(EBV)两种实验室检测方法 的应用特点.方法 采用免疫荧光技术检测124例患儿血清中特异性EBV抗体,同时采用荧光定量PCR检测124例患儿不同标本中的EBV-DNA含量.结果 124例患儿多种标本EBV的VCA-IgM、VCA-IgG、EA-IgG、EBNA-1-IgG、EB-DNA阳性率分别为0、89.5%、23.4%、49.2%、30.3%,EB-DNA与EBNA-1-IgG同时阳性21例.结论 荧光定量PCR方法 检测EBV-DNA,时间短、准确性好、灵敏度高,对患儿EBV感染相关疾病的诊断和鉴别诊断,具有重要作用.
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Notch1在喉鳞状细胞癌中的表达及意义
目的 研究Notch1在喉鳞状细胞癌(简称喉鳞癌)组织及体外培养Hep-2细胞中的表达及其与喉鳞癌病例临床病理资料之间的关系.方法 应用量子点超敏免疫荧光(QDs immunofluorescence)染色法检测Notch1蛋白在95例喉鳞癌、31例声带息肉组织标本及Hep-2细胞中的表达.结果 Notch1在95例喉鳞癌组织中表达阳性率为88.4％,其表达主要定位于细胞质和细胞核.在喉鳞癌组织中Notch1的表达与T分级、临床分期和淋巴结转移有显著相关性.Notch1在喉鳞癌组织细胞核中的阳性表达与T分级、临床分期、病理分级和淋巴结转移有显著相关性.喉鳞癌细胞Hep-2中Notch1表达阳性,且主要定位于细胞质和胞膜中.结论 Notch1与喉鳞癌的发生发展有着重要关系,其作用的具体机制有待深入研究.
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喉鳞状细胞癌中p27和血管内皮生长因子与肿瘤血管形成的关系
我们采用流式免疫荧光技术对45例喉鳞状细胞癌组织中的抑癌基因p27和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达蛋白进行过检测[1,2],现再用FⅧ因子抗体标记肿瘤组织血管内皮细胞,计算肿瘤内微血管密度(intratumoral microvessel density, IMVD),以了解其相互关系.
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巨噬细胞在翼状胬肉发病中的作用探讨
目的 探讨巨噬细胞在翼状胬肉发病中的作用.方法 手术切除的进行期翼状胬肉组织及正常结膜及眼球筋膜组织,以免疫组织化学法对其中的巨噬细胞标志物CD68进行检测;并通过免疫荧光技术对炎性因子MMP-9、VEGF和CD68行双标检测.结果 免疫组化检测结果显示翼状胬肉组织中有大量散在分布的CD68阳性细胞,而正常组织中无明显的此种阳性细胞,二者比较差异有统计学意义(t=10.262,P=0.001);免疫荧光结果显示翼状胬肉中CD68与MMP-9、VEGF共表达.结论 巨噬细胞对翼状胬肉的发展起促进作用.
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5 Hz和20 Hz磁场对中脑神经干细胞分化的影响
目的观察5 Hz和20 Hz磁场(EMF)对新生大鼠中脑神经干细胞神经元向分化的影响.方法神经干细胞分别置于5 Hz和20 Hz正弦交变磁场(8 mT)中诱导分化,每天上午、下午各1次,每次15 min,分别作用1 d、5 d或10 d,同时设立相应的对照组.利用神经元特异性标记物MAP2抗体进行免疫荧光染色,计数MAP2阳性细胞的百分比.结果 5 Hz和20 Hz交变磁场干预1 d,均出现对NSC分化方向的显著影响,即促进NSC神经元向的分化;20 Hz电磁场随干预时程的延长,NSC分化为神经元的比例逐渐增高,以10 d组神经元比例高;5 Hz磁场干预5 d时神经元比例高,10 d时有所下降,但仍高于对照组;20 Hz磁场效应在10 d时显著大于5 Hz磁场.结论 5 Hz和20 Hz电磁场以不同的效应模式促进NSC神经元向的分化,电磁场可以成为NSC定向分化研究的重要手段之一.
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微波免疫荧光法在快速检测淋球菌中的应用价值
淋病(gonorrhoeae)是由淋球菌(neisseria gonorrhoeae)感染引起的一种泌尿生殖系统传染性疾病,是常见的性传播疾病之一.对淋球菌快速而准确的实验室诊断,是淋病诊治中的一个非常重要的环节.为此,我通过长期临床试验,总结出一种快速准确的检测淋球菌的微波免疫荧光技术,并与传统的革兰染色法相比较,现将结果报道如下.
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解析免疫组化实验中手工操作失误导致不良结果及对策分析
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）是由免疫学和传统组织化学相互结合发展而来的一类实验技术，其是利用抗原（antigen）和抗体（antibody）间特异结合的原理，对组织片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位的定性、定位或定量研究的技术，简称免疫组化[1，2]。随着免疫学、免疫化学和组织化学的不断发展进步，以及显微镜的更新进步，免疫组化技术也取得了长足发展，越来越多地渗透到医学及生命科学的各个领域。免疫组化种类很多，按照标记物的不同分类，可分为免疫荧光技术、免疫酶组织化学技术、免疫胶体金组织化学技术、亲和免疫组织化学技术四类，常用的是亲和免疫组织化学技术。因各类技术基本原理相同，使得不同类实验步骤大致相近，但因每一类技术的独特性，其操作步骤本身又都具有其特定性。免疫组化实验步骤繁琐，从取材、固定、组织处理、制片到抗原修复、染色步骤繁多，涉及的试剂至少十种，周期长，而且每个环节环环相扣，看似简单的实验操作，却往往不能得到理想的实验结果。本研究汲取多年科研工作中及培养研究生进行免疫组化技术操作中发现的一系列操作失误及所造成的不良后果进行分析总结如下。
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实验小鼠痘病毒感染检测分析
小鼠痘病毒急性感染可导致实验小鼠脱脚病(鼠痘)发作,临床症状明显,发病动物短期内大量死亡.近10年某地区鼠痘发生次数依次为昆明小鼠(7次)、NIH小鼠(3次)、ICR小鼠(2次)和BABL/c小鼠(1次).无明显临床症状慢性持续性感染(隐性感染),是病毒传播或转化成急性感染主要原因,用免疫荧光技术(IFA)可检测到病毒抗体,鸡胚病毒培养意义不大.流行病学调查证实IFA抗体阳性小鼠群体脱脚病发病率显著高于IFA抗体阴性小鼠群体(P＜0.001).
