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甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析
目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达.方法 根据Genbank(NCBI ISDN13425)中查得的M2e编码序列,设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端,退火后使之互补结合成为M2e编码序列;然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e;经酶切和DNA测序鉴定后,转染HEK293细胞,用免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-M2e在HEK293细胞的表达,并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况.结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链,插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3.1(+)-M2e.免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上,转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖,表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外.结论 成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e,表达的M2e蛋白不仅存在于细胞膜上,也可分泌到细胞外.流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础.
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利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖
[目的] 介绍一种新的检测淋巴细胞增殖的方法.[方法] 用本室构建的重组蛋白疫苗hsp65-CAP3对C57小鼠进行3次免疫后,分离小鼠的脾细胞,以照射灭活的CAP3转基因细胞为刺激细胞,在体外刺激淋巴细胞的增殖反应.淋巴细胞在与刺激细胞共培养之前用绿色荧光染料羧乙基锗倍半氧化物(CFSE)进行标记.在共培养72 h后,用PE标记的抗鼠CD8分子的单抗标记淋巴细胞.收集细胞进行FACS检测,出现在二维点图左上象限的细胞代表CFSE含量减少的CD8+淋巴细胞(CD8+CFSElow)即增殖的CD8+淋巴细胞,利用流式细胞仪记数左上象限CD8+CFSElow细胞的比例.[结果] 经体外刺激的脾淋巴细胞中,实验组CD8+CFSElow的平均百分比值为(16.47±2.10)%,对照组CD8+CFSElow的平均百分比值为(7.69±1.65)%(P<0.05).[结论] 通过FACS结果判定CD8+淋巴细胞发生了特异性的增殖.CFSE标记是一种有效的检测淋巴细胞增殖的方法.
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小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究
目的 构建小鼠β-防御素6(mBD6)与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性.方法 通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e.将其插入戢体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e.鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌.免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达.结果 融合基因mBD6-M2e真核表达栽体pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖.免疫小鼠细胞因子表达改变.结论 融合基因mBD6-M2e真核表达栽体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础.
关键词： β-防御素 6 甲型流感病毒 mBD6-M2e融合基因 淋巴细胞增殖实验
