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大劣按蚊前酚氧化酶基因部分序列的克隆与序列分析
目的克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)前酚氧化酶(Prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核酸序列,然后进行序列查询与比对.结果大劣按蚊PPO基因(AdPPO)部分序列长598 bp,编码199个氨基酸;AdPPO与冈比亚按蚊PPO5基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84.23%和88.89%.结论成功克隆出AdPPO部分序列,其与冈比亚按蚊PPO基因序列具有很高同源性.
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斯氏按蚊PPO1基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究
目的克隆和分析斯氏按蚊前酚氧化酶基因与约氏疟原虫卵囊黑化关系. 方法 根据其他昆虫前酚氧化酶基因的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊RNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm-T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定.根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下前酚氧化酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位及与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析. 结果 获得了1种斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶基因cDNA部分序列,即AsPPO1(600 bp),分别与冈比亚按蚊PPO1和大劣按蚊PPO2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含PO保守的铜结合位点CuA(HHWHWHLVYP)序列.在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血淋巴有AsPPO1 mRNA表达. 结论 AsPPO1很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关.
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一种新的(1→3)-β-D-葡聚糖识别蛋白的鉴定及其分子克隆
目的从大黄粉虫(Tenebrio molitor)体内鉴定出一种 (1→3)-β-D-葡聚糖识别蛋白(Tm-GRP)并对其进行分子克隆.方法通过制备一种β-1, 3-葡聚糖固定化柱,从大黄粉虫的体液中筛选出能与(1→3)-β-D-葡聚糖发生特异性结合的蛋白质.利用DNA探针法和随机引物法从大黄粉虫的cDNA文库中筛选Tm-GRP的全部DNA序列.结果 Tm-GRP是一个由1 443个核苷酸编码产生的具有481个氨基酸残基的蛋白质.结论 Tm-GRP是大黄粉虫体内的一种葡聚糖识别蛋白.
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约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析
目的初步探讨大劣按蚊(Anopheles dirus) 黑化包被约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)卵囊相关蛋白.方法挤压法分别收集血餐后第1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴,经SDS-PAGE分离后,银染显色.同时,用烟草天蛾(Manduca Sexta)前酚氧化酶(Prophenoloxidase, PPO)亚基1 IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO.结果 SDS-PAGE发现感染约氏疟原虫后,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强,而部分血淋巴蛋白带却减弱,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有87×103、67×103、63×105 3条蛋白带,而相应分子量的3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第4、5天开始增强,其中尤以87×103的增强为明显.结论大劣按蚊在对约氏疟原虫卵囊黑化包被期间诱导合成的某些血淋巴蛋白与前酚氧化酶级联反应主要成分有关联.
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大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位
目的克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增、目的片段克隆入T载体,然后,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序;以RT-PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况.结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为597 bp,编码199个氨基酸;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布.结论从大劣按蚊成功克隆获得2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列,为进一步克隆其全序列奠定了基础.
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吸血和约氏疟原虫感染对AdPPOs基因家族转录水平的影响
目的观察血餐和约氏疟原虫感染对AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3基因转录水平的影响.方法同批3～5 d龄大劣按蚊分为不吸血组(N)、吸正常血组(NB)和吸感染血组(IB),在血餐后24 h分别制备各组蚊总RNA,所有样品进行RT-PCR后,各吸取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描并读取数据,并对所得数据进行统计学处理.结果与不吸血组比较,吸血组和感染组AdPPO1的转录水平显著下降(P<0.05),但吸血组和感染组间没有显著性差异(P>0.05).吸血组AdPPO2的转录则明显上调(P<0.05),但与感染组间没有显著性差异(P>0.05);AdPPO3基因的转录水平在3组间均没有显著性差别(P>0.05).结论血餐明显抑制AdPPO1基因的转录,但明显上调AdPPO2基因的转录水平;约氏疟原虫感染后24 h,AdPPO1,AdPPO2和AdPPO3基因的转录水平均不受影响.
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约氏疟原虫感染斯氏按蚊后血淋巴PPO的酶解激活
目的了解约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊是否发生黑化相关性酶级联反应.方法挤压法收集雌斯氏按蚊成蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,然后对血淋巴进行一维和二维SDS-PAGE,继而利用Western印迹分析比较PPO蛋白点的差异.结果约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴蛋白二维凝胶电泳后的Western印迹的PVDF膜上出现2个分子量均约为64×103、等电点分别约为7.4和7.6的两个PPO蛋白点,感染后发现8个蛋白点,36×103分子量处3个,等电点分别约为7.2、7.4和8.0;30×103分子量处5个,等电点分别约为7.0、7.2、7.5、7.6和7.8.结论约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴PPO以异二聚体形式结构性表达于血淋巴内,感染后PPO发生免疫激活反应和酶学分解过程,提示PPO参与疟原虫卵囊黑化包被反应.
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AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析
目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.
