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戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒RNA的动态观察及意义
目前，国内外对戊型肝炎(HE)患者病毒血症已有研究，各家报道有明显不同，我们采用逆转录-聚合酶链反应方法检测32例HE患者系列血清，探明HE患者病毒血症持续时间和消长规律。 检测对象为中国医大二院传染科1995年1月至1996年10月期间住院患者32例，临床诊断为戊型肝炎。分别收集患者病后0～7 d、8～14 d、15～12 d、22～28d系列血清共125份，用异硫氰酸胍一步法抽提HEV RNA。引入一对外引物序列为：外正向引物(4459-4478)5＇- GCATTATGGA GGAGTGT GG-3＇，外反向引物 (4877-4858)5＇- CCAGG GCCC-CAATTCTTG-3＇，一对内引物序列为：内正向引物(4522--4539)5＇-GCGTG-GATCTTGCAGGCC-3＇，内反向引物(4741-4760)5＇-TTCAACTTCAA GCCACA GCC-3＇，进行2次PCR扩增。
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脑胶质瘤Th1/Th2类细胞因子的漂移及意义
我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测了4株脑胶质瘤细胞株、52例新鲜脑胶质瘤标本和15例脑胶质瘤患者外周血标本的Th1/Th2类细胞因子的表达情况，初步探讨了脑胶质瘤Th2类细胞因子漂移的意义。 1．材料与方法：胶质瘤细胞株SHG-44、U251、C6和9L，购自上海细胞生物研究所或本室保存。胶质瘤组织标本52例，取自我院患者，术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。术后病理：星形细胞瘤Ⅰ级4例，星形细胞瘤Ⅱ级6例，间变性星形细胞瘤23例，多形性胶质母细胞瘤9例，少突胶质细胞瘤3例，脉络丛乳头状瘤1例，室管膜瘤2例，髓母细胞瘤4例。胶质瘤患者外周血标本15例，取自术前静脉血。细胞传代收获1×106个细胞；胶质瘤组织约1 cm3大小，仔细去除坏死组织；外周血5～10 ml，肝素抗凝，Ficoll梯度离心法分离出单个核细胞；总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法［1］。（1）检测指标：以IFN-γ、IL-2代表Th1类因子，IL-4、IL-6、IL-10、IL-13代表Th2类细胞因子，β-actin为内参照。（2）逆转录反应：5～10 μg细胞总RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl、4×dNTP 1 μl、M-MLV 1 μl (200 U)、下游引物P2 1 μl(50 pmol/L)，总体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活M-MLV。（3）PCR反应：继续加入25 mmol/L MgCl2 8 μl、4×dNTP 1 μl、上游引物P1 1 μl,总体积98 μl；95 ℃ 5 min后，加入Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl) 。循环条件为94 ℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，后72℃延长7 min。（4）1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。
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风湿性心脏病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体mRNA的变化
肾上腺髓质素是一种内源性神经肽，它参与了肺动脉高压的形成［1］，其作用机制之一是通过特异性受体发挥扩血管作用。我们采用印迹杂交(Northern blot)法检测风湿性心病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体(AM-R)mRNA的表达，以期探讨肾上腺髓质素在肺动脉高压中的作用机制。 一、材料和方法 1.标本来源：风湿性心脏病患者右肺组织18例，其中男11例，女7例，平均年龄31.7岁。根据平均肺动脉压分为3组［2］，每组6例：平均肺动脉压＜2.80 kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)为肺动脉压正常组；2.80～5.33 kPa为肺动脉高压组；＞5.33 kPa为严重肺动脉高压组。正常对照组为无心肺疾病的患者右肺组织5例。 2.探针：人AM-R cDNA探针 (美国 Montuenga 博士惠赠)。 3.方法：(1)肺组织总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法。(2)RNA甲醛变性：取20 μg RN A，加入1×电泳缓冲液、体积分数为17.5%甲醛和50.0%甲酰胺，65 ℃水浴20 min，冰浴2 min。(3)RNA电泳：在质量分数为1%甲醛凝胶、1×电泳缓冲液中80 V预电泳5 min，65 V恒压电泳2 h左右。(4)转膜：采用真空转印仪，20×标准柠檬酸盐中负压400 MPa持续转印0.5 h。(5)Northern blot分析：将尼龙膜放入杂交炉中，55 ℃，转速12 r/min，预杂交4～6 h。再将用α-32P 3-磷酸核糖腺嘌啉标记好的AM-R cDNA探针，加入杂交管中，相同条件下杂交24～36 h。(6)杂交信号的密度扫描：放射自显影后，X光片经显影、定影、水洗、室温下凉干用计算机图像分析仪扫描分析，将各点杂交信号做面积和灰度测定，然后用同一样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的杂交信号值做校正，即：AM-R mRNA(%) = (AM-R杂交信号面积×AM-R杂交信号灰度值)/(3-磷酸甘油醛脱氢酶杂交信号面积×杂交信号灰度值)×100%。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示，进行方差分析。 二、结果 严重肺动脉高压组、肺动脉高压组、肺动脉压正常组肺组织AM-R mRNA分别为(76.00±1 1.50)%、(97.26±5.79)%、(105.41±12.24)%，合并肺动脉高压组 AM-R mRNA表达明显低于正常对照组(119.31±16.29)%(P＜0.05)，肺动脉压正常组 AM-R mRNA表达与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)，严重肺动脉高压组AM-R mRN A表达明显低于肺动脉压正常组(P＜0.05)。
