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MPO及Ox-HDL可能通过调节单核细胞 NLRP3表达影响IL-1β的产生
目的：观察不稳定型心绞痛患者外周血单核细胞MPO和NLRP3表达水平，并分析其相关性。观察MPO及ox-HDL对人单核细胞NLRP3、IL-1β的调节作用。
方法：本研究入选120例受试者，其中不稳定型心绞痛患者80例（UA组），均为近一次胸痛发作12 h以内入院的患者[平均胸痛时间为（7.13±1.91） h]。按性别和年龄匹配入选正常健康人群40例（对照组）。在入院时即刻经肘静脉采外周血，用梯度离心法，分离单核细胞。用流式细胞技术检测外周血单核细胞MPO及NLRP3表达水平，并用ELISA法检测血浆IL-1β水平。用MPO、HDL及ox-HDL处理THP-1单核细胞24 h后，用RT-PCR及Western blot检测细胞NLRP3及其下游caspase-1和IL-1β的表达水平。用特异性siRNA敲减THP-1单核细胞NLRP3后，再用MPO，HDL及ox-HDL处理细胞，观察NRP3下游分子caspase-1和IL-1β的表达水平。 -
赤芍川芎有效部位配伍对急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的干预效应研究
目的：研究赤芍川芎有效部位配伍对急性心肌梗死大鼠模型血小板活化及血小板Gelsolin水平的干预效应。
方法：通过结扎前降支方法建立急性心肌梗死大鼠模型，以赤芍川芎有效部位配伍药物芎芍胶囊（XSC）作为干预药物，同时以阿司匹林及钙离子拮抗剂维拉帕米作为阳性对照药物，观察芎芍胶囊对模型大鼠血小板活化及血小板Gelsolin含量及其相关指标的干预效应。血浆梯度离心法获得大鼠PRP和PPP，使用ELISA法测定Gelsolin、F-actin、DBP、P-选择素以及CK-MB、cTnI的含量，使用流式细胞术测定大鼠血小板钙离子浓度，使用WB法测定梗死区心肌组织Gelsolin的蛋白表达。 -
脑胶质瘤Th1/Th2类细胞因子的漂移及意义
我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，检测了4株脑胶质瘤细胞株、52例新鲜脑胶质瘤标本和15例脑胶质瘤患者外周血标本的Th1/Th2类细胞因子的表达情况，初步探讨了脑胶质瘤Th2类细胞因子漂移的意义。 1．材料与方法：胶质瘤细胞株SHG-44、U251、C6和9L，购自上海细胞生物研究所或本室保存。胶质瘤组织标本52例，取自我院患者，术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。术后病理：星形细胞瘤Ⅰ级4例，星形细胞瘤Ⅱ级6例，间变性星形细胞瘤23例，多形性胶质母细胞瘤9例，少突胶质细胞瘤3例，脉络丛乳头状瘤1例，室管膜瘤2例，髓母细胞瘤4例。胶质瘤患者外周血标本15例，取自术前静脉血。细胞传代收获1×106个细胞；胶质瘤组织约1 cm3大小，仔细去除坏死组织；外周血5～10 ml，肝素抗凝，Ficoll梯度离心法分离出单个核细胞；总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法［1］。（1）检测指标：以IFN-γ、IL-2代表Th1类因子，IL-4、IL-6、IL-10、IL-13代表Th2类细胞因子，β-actin为内参照。（2）逆转录反应：5～10 μg细胞总RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl、4×dNTP 1 μl、M-MLV 1 μl (200 U)、下游引物P2 1 μl(50 pmol/L)，总体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活M-MLV。（3）PCR反应：继续加入25 mmol/L MgCl2 8 μl、4×dNTP 1 μl、上游引物P1 1 μl,总体积98 μl；95 ℃ 5 min后，加入Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl) 。循环条件为94 ℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，后72℃延长7 min。（4）1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。
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国产去白细胞滤器使用效果评价
血液中的白细胞有粒细胞和淋巴细胞,粒细胞有输血治疗作用,而淋巴细胞不但无治疗意义,相反,当将异体供者的淋巴细胞输入人体,由于复杂的HLA抗原系统,必然与受者发生同种异体反应而产生白细胞抗体,从而导致不良反应,如非溶血性发热反应(NHFTR),同种异体免疫反应(alloimmunization),血小板输注无效(platelet refractoriness),免疫抑制(immunosuppression),移植物抗宿主病(GVHD)及病毒感染(virus infection).因此,血液中含有残留白细胞是一种有危害的污染物,应予除去.去除全血和血液成分中的白细胞有多种方法,如细胞洗涤法(白细胞去除率为80%)、梯度离心法(白细胞去除率为65%～88%)、冰冻法(白细胞去除率为95%)、右旋糖酐沉降法(白细胞去除率为82%～95%)、紫外线照射法和γ-射线照射法、单采法以及过滤法等[1].
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三种精液处理方法所得精子的体外观察分析
精液处理是人工授精和试管婴儿过程中重要的一环,优化处理精液是为了提高精子的密度和活力,并去除精浆内的前列腺素、抗精子抗体、炎症细胞等不良成分.
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圆形精子细胞的分离和体外成熟
为了探讨联合应用圆形精子细胞分离和体外成熟的方法改善它们的质量和提高受精能力,使用间断梯度离心法分离不成熟的生殖细胞,然后与Vero细胞共培养将圆形的精子细胞变成为更成熟的形式,总共对87个精子细胞进行了研究,结果表明在后的77个细胞中,仅有12个表现出一定程度的成熟,占7个病人中的3个(42%),在这12个成熟精子细胞中,只有4个发展到早期延长的精子细胞阶段(Scl),但是没有鞭毛.结论:研究表明本文中体外圆形精子细胞的成熟是有限的,精子细胞和圆形精子细胞的受精率和妊娠率比例低,将该方法常规用于临床尚需要技术改进方面的进一步探索.(戴继灿摘译,黄平治校)
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Isolate液处理异常精液行宫腔内人工授精的应用评价
为寻求简便、高效的精液处理方法,2002年7月～2003年12月,我院通过对不同程度少弱精子症患者精液采用Earle液上游法和双层Isolate液梯度离心法进行对比研究,现报道如下.
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假体周围骨溶解组织中磨损颗粒的提取与分析
目的观察、分析假体周围骨溶解组织中磨损颗粒的分布情况,为体外及体内磨损试验提供颗粒.方法从一个临床严重骨溶解的髋关节翻修病例术中的骨溶解组织,采用强碱消化法提取磨损颗粒,密度梯度离心法纯化金属颗粒直径,通过组织学观察颗粒在组织中的分布,等离子光谱分析仪(ICP-AES)、偏光镜分析颗粒成分,扫描电镜、颗粒计数仪观察颗粒大小形态.结果磨损颗粒在骨溶解组织中分布不均匀;磨损颗粒主要成分为钛合金、聚乙烯、含硫酸钡骨水泥;组织中颗粒大小变化较大,聚乙烯颗粒直径为0.13～37.00 μm,钛合金颗粒直径为0.05～49.30 μm,金属颗粒密度梯度离心后平均直径为0.85 μm ,约90%颗粒直径在0.50～1.00 μm.结论通过强碱消化及密度梯度离心提取、纯化假体周围骨溶解组织中磨损颗粒的方法可提供符合试验需要的金属颗粒.
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小鼠Kupffer细胞分离及细胞培养
目的 采用在体胶原酶灌注、不连续密度梯度离心、选择性贴壁3步法分离Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs),探讨其在分离小鼠KCs的应用及其对KCs生物活性的影响.方法 根据原位灌注和梯度离心方法不同随机分为4组:无胶原酶原位灌注+3层梯度离心组(A)、无胶原酶原位灌注+双层梯度离心组(B)、胶原酶原位灌注+3层梯度离心组(C)和胶原酶原位灌注+双层梯度离心组(D).采用F4/80(BM8)免疫染色及吞墨实验判断细胞纯度和功能、台盼蓝拒染实验判断细胞的活力,探讨不同方法KCs分离的效果及细胞活性.结果 刚分离的KCs细胞近似圆形,接种l h后收获细胞纯度较高,但细胞得率相对较低.培养4 h后KCs得率相对较高,培养28 d仍能存活.免疫荧光可显示分离的为KCs,台盼蓝染色显示各组细胞的活力均在90 %左右,在体胶原酶灌注和双层梯度离心可以增加KCs的得率,双层梯度离心法可以增加分离KCs的纯度.结论 在体胶原酶灌注对提高KCs得率较为重要,在体胶原酶灌注、不连续密度梯度离心、选择性贴壁3步法分离小鼠KCs的的方法简便、高效、稳定,培养的KCs具有良好的细胞生物学性状.
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人LAK细胞免疫效应分子HMGN2的鉴定
目的:从人LAK细胞分离纯化和鉴定小分子抗菌多肽.方法:用Hypaque-Ficoll梯度离心法从人外周血分离单核白细胞,经IL-2和PHA刺激培养后,5%乙酸匀浆细胞获取酸溶性提取物,应用制备尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反向高效液相色谱技术分离纯化多肽,N-端氨基酸测定和质谱分析鉴定其分子特性.免疫荧光化学、ELISA和Western Blotting方法进行定位分析.
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梯度离心法制备骨髓间充质干细胞胞质体及其鉴定
目的 建立制备骨髓间充质干细胞胞质体的方法 ,以用于体细胞核移植研究. 方法 (1)培养骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD71、CD11b;(2)用梯度离心法制备骨髓间充质干细胞胞质体,并用HE染色、Giemsa染色、荧光双标染色、透射电镜检查等方法 进行鉴定,用台盼蓝染色检测其活性. 结果 (1)骨髓间充质十细胞呈长梭形、漩涡状生长.骨髓问充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD71表达阳性,CD11b表达阴性;(2)HE染色、Giemsa染色、荧光双标染色和透射电镜检查显示骨髓间充质干细胞经梯度离心后在15%～18%Ficoll400梯度层可收集到大量胞质体,胞质体可快速贴壁,表达CD71,与完整骨髓间充质干细胞相似,体积与完整细胞相比差别不大.有活性的胞质体比例达99.5%. 结论 用梯度离心法可有效获得骨髓间充质干细胞胞质体.
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受精障碍夫妻双方染色体异常一例
患者女,30岁.因原发性不孕、双侧输卵管梗阻于2001 年8月在我院采用GNRH-а长方案控制性促排卵,待主卵泡直径达18 mm时肌注绒毛膜促性腺激素10 000 U,36 h后超声引导下取得8个成熟卵子,常规洗卵、装卵、CO2培养箱培养.丈夫精液除液化困难外其余指标均正常,Isolate梯度离心法处理精液,取卵后4 h以精子∶卵子约30 000∶1的比例授精,培养14 h后去除颗粒细胞后于倒置显微镜下观察,未发现有受精原核,卵细胞裸露,精子游离于卵细胞周围,确认为受精障碍.夫妻双方外周血染色体检查,患者染色体核型:46,XX,1号次缢痕正位重复偶见1号短臂断裂.丈夫染色体核型为46,XY,inv(9).
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多级梯度离心后X/Y精子浓度分析
目的 在辅助生殖中,利用多层密度梯度离心的方法来分选X/Y精子,以检验常规IVF-ET中,X/Y精子比例是否失衡.方法 使用SpermGradTM (Vitrolife,Sweden)与SpermRinseTM (Vitrolife,Sweden)配制10层梯度液,分别为100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％.在离心管中制成多层梯度后,每层梯度间分界明显.选择液化正常、浓度约50×106/mL、活动率约50％,畸形率正常的5人精液混合后,去除个体差异取3 mL进行梯度离心.分别收集每层梯度底部精子,利用双色X/Y FISH探针(Vysis)进行FISH检测,统计X/Y精子比例.结果 100％、95％、90％、85％、80％五层梯度中X精子含量比例分别为:51.41％、51.41％、52.19％、50.99％、54.10％.结论 每层梯度液中X/Y精子含量比例虽有不同,但差异并不明显.现在辅助生殖技术中,利用商品化精子梯度分离液,即使使用多层梯度进行离心分离,也不会造成性别比例失衡.
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梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及临床相关性研究
目的研究梯度离心法在肿瘤药敏试验中的应用及肿瘤药敏试验与临床个体化化疗的相关性.方法取46例肿瘤患者新鲜癌细胞,梯度离心后用MTT法检测癌细胞对8种常用抗癌药的敏感性;根据药敏结果对患者进行化疗,无敏感药物者按经验方案化疗,观察实验与临床疗效的相关性.结果改良法癌细胞获得百分率为94.65±28.47,与传统方法比较差异有显著性(P＜0.01);药敏试验阳性者25例,阴性者21例.实验提示敏感药物化疗者的有效率为76%(19/25);耐药者按经验方案化疗,有效率为28.6%(6/21).P＜0.01,差异有显著性;实验与临床符合率达73.9%(34/46).结论梯度离心MTT法体外癌细胞药敏试验能更好的指导临床个体化治疗,具有预见癌症患者临床个体化化疗疗效的重要价值.
