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乙型肝炎病毒前-X在大肠杆菌中的表达和纯化
目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白,并进行纯化和鉴定.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-X基因,将前-X克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot.结果:成功扩增获得HBV的前-X编码基因片断,并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导,裂解,SDS-PAGE,结果显示得到了目的蛋白Mr27000.以抗-His的单克隆抗体进行的western blot杂交实验,结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.结论:成功表达HBV的前-X蛋白,对于研究HBV的前-X蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.
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乙型肝炎病毒前-前-S蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
目的:在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S蛋白,并进行纯化和鉴定.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-前-S基因,将前-前-S克隆至PET32a+,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot.结果:成功扩增获得HBV的前-前-S编码基因片断,并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导,裂解,SDS-pAGE,结果显示得到了目的蛋白Mr28 000.以抗-His的单克隆抗体进行的western blot杂交实验,结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.结论:成功表达HBV的前-前-S蛋白,对于研究HBV的前-前-S蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.
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一种检测弓形虫抗体的快速ELIB技术
酶联免疫印迹技术(ELIB)作为一项新的免疫学技术,因其高分辨率、高灵敏度及高特异性等优点,广泛应用于寄生虫抗原的分析、纯化和鉴定等.但由于ELIB技术是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白转印以及固相免疫标记等3项技术结合而成,操作时间较长,因而未能成为常规的免疫诊断方法.我们在检测弓形虫抗体时,引进PhastSystem全自动水平电泳系统,该系统电泳凝胶厚度薄(<0.5mm),易冷却,且电场强度高,具有快速和高分辨率等特点,再加上半干式电转移配置,使得SDS-PAGE及电转印的时间均大为减少,仅需30min,全过程也不到5h;只需微量样品,可检出弓形虫IgG和IgM两种抗体.在诊断弓形病中具有应用价值.现介绍如下.
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人LAK细胞免疫效应分子HMGN2的鉴定
目的:从人LAK细胞分离纯化和鉴定小分子抗菌多肽.方法:用Hypaque-Ficoll梯度离心法从人外周血分离单核白细胞,经IL-2和PHA刺激培养后,5%乙酸匀浆细胞获取酸溶性提取物,应用制备尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反向高效液相色谱技术分离纯化多肽,N-端氨基酸测定和质谱分析鉴定其分子特性.免疫荧光化学、ELISA和Western Blotting方法进行定位分析.
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催乳素的分子结构及分泌调节机制
催乳素(prolactin,PRL)是由垂体前叶嫌色细胞分泌的一种多肽,属蛋白类激素.早于1928年在牛垂体前叶中发现,1932年被纯化.上世纪60年代从羊垂体中分离、纯化和鉴定了羊的PRL,之后相继分离、鉴定了鱼类、两栖类及哺乳类等多种动物的PRL.1970年从人垂体腺中分离出人催乳素(hPRL),1971年Friesen采用放射免疫法在人血中检测出该物质.
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重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定
目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.
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琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测肠道菌群基因扩增产物的方法学比较研究
琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis, AGE))和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖凝胶电泳的有效分离范围是0.1~2kb,聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5~500 bp)效果好,分辨力极高,测序的聚丙烯酰胺凝胶可分离相差lbp的DNA片段.