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内参照基因表达检测在宫颈石蜡组织原位杂交中的运用及意义
原位核酸杂交目前已广泛运用于组织和细胞基因表达定位和水平测定.但在实际运用中存在两个主要问题:(1)标本间的定量比较,缺乏比较的基准;(2)对于阴性结果,如何区别杂交失败的阴性结果和由于RNA的降解而出现的阴性结果.3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β-肌动蛋白为细胞的看家基因,其表达水平在不同活动中相对稳定,被广泛运用于基因表达水平检测的内参照基因[1-3],但尚未在原位杂交中作为内参照基因运用.我们通过制备GAPDH和β-肌动蛋白探针,对存档的正常和病理宫颈石蜡组织做了原位杂交检测,并与抑癌基因p53、癌基因c-myc的表达改变相比较,探讨其表达检测是否可作为组织和细胞原位杂交的阳性对照或基准.
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原发性膀胱移行细胞癌p15及p16基因缺失的研究
在人类多种类型的肿瘤中频繁出现染色体9p21-22区域改变[1],这提示该区的改变可能与肿瘤的发生、发展有关.p15、p16基因位于该区,为阐明其在原发性膀胱移行细胞癌(TCC)中的作用,作者对其在膀胱TCC中的缺失改变进行了研究.一、材料与方法1. 标本来源:38例病理检查证实的原发性膀胱TCC和9例正常膀胱粘膜标本由近两年武汉大学中南医院泌尿外科手术获取. -70℃冰箱速冻保存, 以供提取DNA.2. DNA提取及聚合酶链反应(PCR)方法建立:组织DNA提取依常规方法进行.正常膀胱粘膜DNA作对照,3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作内对照,扩增p15、p16基因2个外元,即外元1和外元2.引物设计: p15E1: 5′ CGGAGCA-GCGTGGGAAAG3′, 5′CTGGATCGCGCGCCTCCC3′; p15E2: 5′GCTCCACCTGCCTTGCCCCG3′, 5′ATTAGGTGGGTGGGGGT-GGG3′; p16E1: 5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′, 5′GCGCTA-CCTGATTCCAATTC3′; p16E2: 5′CATTCTGTTCTCTCTGGCAG-3′, 5′CTCAGATCATCAGTCCTCAC3′.反应体系50 μl,模板DNA0.2 μg,MgCl2 1.5 mmol/L,KCl 50 mmol/L,Tris·Cl 10 mmol/L,dNTP0.2 mmol/L,每对引物各20 pmol/L,混匀后液体石蜡覆盖在PCR 扩增仪(GeneAmp PCR system 2400,美国Perkin-Elmer公司)上扩增.扩增条件:95℃预变性5 min,55℃加 Taq DNA多聚酶1.25U,接着94℃,60 s;48℃~55℃,60 s;72℃,60 s;35个循环,后72℃延伸5 min.扩增产物在2.0%醇脂糖凝胶电泳紫外灯下观察,分析缺失结果.
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3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD)诊断试剂盒的研制及对心梗病人诊断价值的研究
3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceral-dehyde-3-phosphate dehyrogenase,GAPD)广泛存在于人体各组织和器官,心肝含量相近,为脂肪组织的30倍.我们从2003年起对GAPD诊断试剂盒进行了研制,建立了检测方法(动力学法),制备成了试剂盒.并对90例急性心肌梗死病人,90例健康人分别进行了GAPD检测分析,GAPD对急性心肌梗死病人有较高的特异性和灵敏度.可提高急性心梗病人早期诊断率.为急性心梗病人提供了新的诊断指标.GAPD检测试剂盒测定简便、快速、准确、可用于各型自动生化分析仪、易于推广和普及,具有广阔的应用前景,可获得较好的经济和社会效益.
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恶性疟原虫FCCI/HN株3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的序列测定
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是疟原虫糖酵解过程中重要的酶,其基因近被发现[1].本文报告恶性疟原虫FCCI/HN株GAPDH基因序列测定结果.
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风湿性心脏病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体mRNA的变化
肾上腺髓质素是一种内源性神经肽,它参与了肺动脉高压的形成[1],其作用机制之一是通过特异性受体发挥扩血管作用。我们采用印迹杂交(Northern blot)法检测风湿性心病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体(AM-R)mRNA的表达,以期探讨肾上腺髓质素在肺动脉高压中的作用机制。 一、材料和方法 1.标本来源:风湿性心脏病患者右肺组织18例,其中男11例,女7例,平均年龄31.7岁。根据平均肺动脉压分为3组[2],每组6例:平均肺动脉压<2.80 kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)为肺动脉压正常组;2.80~5.33 kPa为肺动脉高压组;>5.33 kPa为严重肺动脉高压组。正常对照组为无心肺疾病的患者右肺组织5例。 2.探针:人AM-R cDNA探针 (美国 Montuenga 博士惠赠)。 3.方法:(1)肺组织总RNA提取:采用异硫氰酸胍一步法。(2)RNA甲醛变性:取20 μg RN A,加入1×电泳缓冲液、体积分数为17.5%甲醛和50.0%甲酰胺,65 ℃水浴20 min,冰浴2 min。(3)RNA电泳:在质量分数为1%甲醛凝胶、1×电泳缓冲液中80 V预电泳5 min,65 V恒压电泳2 h左右。(4)转膜:采用真空转印仪,20×标准柠檬酸盐中负压400 MPa持续转印0.5 h。(5)Northern blot分析:将尼龙膜放入杂交炉中,55 ℃,转速12 r/min,预杂交4~6 h。再将用α-32P 3-磷酸核糖腺嘌啉标记好的AM-R cDNA探针,加入杂交管中,相同条件下杂交24~36 h。(6)杂交信号的密度扫描:放射自显影后,X光片经显影、定影、水洗、室温下凉干用计算机图像分析仪扫描分析,将各点杂交信号做面积和灰度测定,然后用同一样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的杂交信号值做校正,即:AM-R mRNA(%) = (AM-R杂交信号面积×AM-R杂交信号灰度值)/(3-磷酸甘油醛脱氢酶杂交信号面积×杂交信号灰度值)×100%。 4.统计学方法:数据以均数±标准差(****±s)表示,进行方差分析。 二、结果 严重肺动脉高压组、肺动脉高压组、肺动脉压正常组肺组织AM-R mRNA分别为(76.00±1 1.50)%、(97.26±5.79)%、(105.41±12.24)%,合并肺动脉高压组 AM-R mRNA表达明显低于正常对照组(119.31±16.29)%(P<0.05),肺动脉压正常组 AM-R mRNA表达与正常对照组差异无显著性(P>0.05),严重肺动脉高压组AM-R mRN A表达明显低于肺动脉压正常组(P<0.05)。