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睡眠呼吸暂停综合征患者组织纤溶酶原激活物抑制物1 4G/5G基因多态性分析
睡眠呼吸暂停综合征(SAS)是一种睡眠呼吸障碍，因睡眠过程中反复呼吸浅慢或暂停，导致睡眠时出现低氧和高碳酸血症，与多种心血管系统疾病关系密切［1，2］。我们借助分子生物学技术，研究SAS患者组织纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）活性、含量与PAI-1 4G/5G基因多态性及mRNA表达的关系，以期为SAS与其他心血管系统疾病之间的相互关系提供分子水平的依据。 材料与方法 (1) 临床资料：依据睡眠呼吸监测的结果，将实验对象分为两组，正常对照组30例，其中男20例，女10例，平均年龄（56±11）岁； SAS组30例，其中男20例，女10例，平均年龄（57±9）岁。(2) 用发色底物法测定PAI-1活性，用ELISA法测定PAI-1含量。(3) DNA的提取采用盐析法［1］。RNA的提取采用TRIzol一步法（根据TRIzol试剂说明书）。(4) PAI-1 4G/5G基因多态性分析：加入上游引物（CACAGAGAGAGTCTGGACAC-GT）及下游引物（AGACC-AAGAGTCCTCTGTTGG）各15 pmol，经95℃预变性2 min，95℃变性60 s，58℃复性60 s，72℃延伸45 s，共进行35个循环，后72℃延伸2 min。Bsl I 对扩增产物进行酶切。紫外灯下观察结果并拍照。(5) PAI-1 mRNA表达水平的测定：加入下游引物（GAGAACTTGGG-CAGAACCAG）25 pmol，进行逆转录，取5 μl逆转录反应产物，加入上游引物（CCACTTCTTCAGGCT-GTTCC）25 pmol及β-ectin（上游引物CCTCTAT-GCCA ACACAGTGC及下游引物GTAC-TCCTGCTTGCTG-ATCC）各25 pmol，经95℃预变性90 s，95℃变性30s，56℃复性60 s，72℃延伸60 s，共进行35个循环，后72℃延伸10 min。(6) 经4.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照，得到的负片进行光密度扫描、定量。(7) 采用SPSS软件包对结果进行统计学分析。
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预变性周围神经移植和神经生长因子灌注对脊髓损伤后上行传导束再生的影响
目的:评价应用预变性周围神经移植(PPNG)和神经生长因子(NGF)灌注对大鼠脊髓损伤(SCI)后上行传导束再生的影响及两者协同效果.方法:50只SD大鼠分5组,每组10只,A组为PPNG和NGF灌注组;B组为PPNG组;C组为NGF灌注组;D组为单纯损伤组;E组为正常对照组.A、B组于脊髓损伤前1周取坐骨神经约3mm并置于DMEM中.1周后造成T10脊髓后索损伤并将预变性的外周神经植入,A、C组脊髓损伤后置管注射NGF,每日2μg,共2周;D组单纯损伤脊髓,E组不损伤脊髓.8周后行辣根过氧化物酶(HRP)示踪法计数再生的纤维,按照脊髓与移植物的关系分为脊髓尾端、尾端过渡区、移植物尾端、移植物头端、头端过渡区、脊髓头端六个区,简称Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ区.结果:在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ区,A组标示的纤维数量显著高于B、C组(P＜0.05),Ⅵ区均无示踪纤维;D组几无纤维通过移植物.结论:联合应用PPNG及NGF灌注可明显促进大鼠SCI后上行传导束的再生,使再生的纤维跨过两道瘢痕,重新长入脊髓白质内.
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原发性膀胱移行细胞癌p15及p16基因缺失的研究
在人类多种类型的肿瘤中频繁出现染色体9p21-22区域改变[1],这提示该区的改变可能与肿瘤的发生、发展有关.p15、p16基因位于该区,为阐明其在原发性膀胱移行细胞癌(TCC)中的作用,作者对其在膀胱TCC中的缺失改变进行了研究.一、材料与方法1. 标本来源:38例病理检查证实的原发性膀胱TCC和9例正常膀胱粘膜标本由近两年武汉大学中南医院泌尿外科手术获取. -70℃冰箱速冻保存, 以供提取DNA.2. DNA提取及聚合酶链反应(PCR)方法建立:组织DNA提取依常规方法进行.正常膀胱粘膜DNA作对照,3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作内对照,扩增p15、p16基因2个外元,即外元1和外元2.引物设计: p15E1: 5′ CGGAGCA-GCGTGGGAAAG3′, 5′CTGGATCGCGCGCCTCCC3′; p15E2: 5′GCTCCACCTGCCTTGCCCCG3′, 5′ATTAGGTGGGTGGGGGT-GGG3′; p16E1: 5′GAAGAAAGAGGAGGGGCTG3′, 5′GCGCTA-CCTGATTCCAATTC3′; p16E2: 5′CATTCTGTTCTCTCTGGCAG-3′, 5′CTCAGATCATCAGTCCTCAC3′.反应体系50 μl,模板DNA0.2 μg,MgCl2 1.5 mmol/L,KCl 50 mmol/L,Tris·Cl 10 mmol/L,dNTP0.2 mmol/L,每对引物各20 pmol/L,混匀后液体石蜡覆盖在PCR 扩增仪(GeneAmp PCR system 2400,美国Perkin-Elmer公司)上扩增.扩增条件:95℃预变性5 min,55℃加 Taq DNA多聚酶1.25U,接着94℃,60 s;48℃～55℃,60 s;72℃,60 s;35个循环,后72℃延伸5 min.扩增产物在2.0%醇脂糖凝胶电泳紫外灯下观察,分析缺失结果.
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许旺细胞提取与纯化的新方法
背景:许旺细胞移植可改变损伤局部的微环境,有利于神经创伤的修复,获取大量高纯度、具有增殖活性的许旺细胞是研究的关键.目的:探求一种简单且快速提取和纯化许旺细胞的方法.方法:实验组大鼠在无菌条件下切断坐骨神经远端,使坐骨神经在体内预变性;对照组大鼠的坐骨神经不予任何处理.术后7 d切取两组坐骨神经,采用混合酶消化、组织块移植法提取许旺细胞:通过低酶消化、2次接种差速贴壁法分离纯化许旺细胞.相差显微镜下观察细胞形态,并行免疫荧光染色鉴定:计算细胞纯度:MTT法检测细胞增殖能力.结果与结论:实验组培养第7天可见典型呈双极或三极的许旺细胞,细胞间建立连接:对照组细胞突起较短,与周围细胞较少关联.S-100免疫荧光染色后,细胞呈阳性绿色表达.实验组细胞增殖较快,第15天迅速形成漩涡状,成纤维细胞数量相对较少,细胞纯度达96.1%;对照组细胞在培养过程中增殖较缓慢,成纤维细胞数量多,细胞纯度较低.MTT法检测结果显示,原代培养时两组许旺细胞增殖能力均较弱;传代后与对照组比较,实验组许旺细胞增殖能力明显增强(P<0.05或0.01),第三四代达峰值.结果证实体内预变性、体外混合酶消化、组织块移植结合低酶消化、双差速贴壁分离许旺细胞是一种简便、快速的提取纯化许旺细胞的方法.
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自身免疫性甲状腺病与促甲状腺激素受体基因突变的关系
自身免疫性甲状腺病(AITD)是一组器官特异性自身免疫疾病。主要包括Graves病(GD)、桥本甲状腺炎(HT)和原发性粘液性水肿。促甲状腺激素受体(TSHR)是AITD发病中重要的自身抗原，对其遗传变异的研究具重要意义。人类TSHR基因位于染色体14q31处，全长60 kb，包括10个外显子和9个内含子，第1至9号外显子编码TSHR氨基酸膜外区的部分，跨膜区和膜内区部分由第10号外显子编码〔1〕。研究表明，自主性功能性甲状腺腺瘤，遗传或散发性毒性甲状腺增生症，先天性甲减等多种甲状腺疾病与TSHR基因突变密切相关，对于Graves病和桥本甲状腺炎，这方面的研究较少。目前有G205C体细胞突变，C253A原始细胞突变的报道〔2，3〕，但尚存争议。本研究初步探讨AITD与TSHR基因突变的关系。 一、对象和方法 1.对象：123例无亲缘关系的西北地区汉族人。其中GD患者48例(男15例，女33例)，均具典型的高代谢症群，不同程度弥漫性甲状腺肿，实验室检查符合甲亢改变。大部分经甲状腺病理学检查确诊。HT患者50例(男4例，女46例)，根据甲状腺肿大，甲状腺自身抗体滴度及甲状腺病理检查确诊。健康人25例(男7例，女18例)，均无甲状腺疾病史及家族史，甲状腺功能测定在正常范围。 2.方法：(1)基因组DNA的提取：采外周血5 ml(ACD抗凝)，分离单个核细胞，饱和酚/氯仿抽提基因组DNA。(2)聚合酶链式反应(PCR)：引物1：上游引物5'-TCCCG～GGTCTCCTTTGGCCT-3'(position 5-24)，下游引物5'-GGTACTCACAGAGTCTGCGT-3'(position 269-259及9个第1号内含子碱基序列)，扩增第1号外显子，长度274bp。引物2：上游引物5'-ATCCTTGAGTCCTTGATGTG-3'(position 982-1001)，下游引物5'-TACTCTTCTGAGATTTGG～CC-3'(position 2375-2356)，扩增第10号外显子，长度1394bp(中科院微生物研究所合成)。反应体系50 μl，含模板DNA 200～500 ng，上下游引物各0.25 μmol/L，dNTP各200 μmol/L(SABC)，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×PCR缓冲液5 μl,Mg2+ 1.5 mmol/L(上海生工)。循环参数设置：①扩增第1号外显子。94℃预变性90秒，94℃，60秒，55℃，60秒，72℃，60秒，30次循环，72℃后延伸5分钟。②扩增第10号外显子。94℃预变性90秒，94℃，60秒，55℃， 60秒，72℃，90秒，30次循环，72℃后延伸5分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实。(3)限制性片段长度多态性分析(RFLP)：选取Taq Ⅰ(SABC)、Msp Ⅰ(SABC)、Hinf Ⅰ(MBI)、Bsr Ⅰ(MBI)四种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。 3.统计学处理：行列表χ2检验。
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生长因子促进转基因小鼠坐骨神经体外预变性的实验研究
目的 探索一种简便高效的小鼠坐骨神经体外预变性的方法,以便在短期内获取大量高活性的雪旺细胞.方法 选用绿色荧光蛋白(GFP)转基因的小鼠24只,随机分为A、B、C和D四组.A、B、C组切取双侧坐骨神经,分别置于DMEM、DMEM+10％FBS及含生长因子的雪旺细胞培养液中体外预变性1周,D组切断一侧坐骨神经体内预变性1周.1周后取材,行免疫组织学和细胞学方面的检测,比较各组获取的雪旺细胞量和纯度.结果 C组获得的雪旺细胞量及纯度较高,与D组的雪旺细胞相似.结论 生长因子能促进小鼠坐骨神经的体外预变性,具有与体内预变性相似的效果,能在短期能获得大量雪旺细胞.
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不同延迟时间后修复大鼠坐骨神经缺损对CGRP表达的影响
目的:观察大鼠坐骨神经缺损不同延迟时间后修复对降钙素基因相关肽(CGRP)表达的影响.方法:大鼠右侧坐骨神经切断分别预变性0、3、7、14和21 d后(n=6)以左侧自体新鲜神经桥接,神经再生6周后用免疫组化方法检测CGRP在脊髓和背根节(DRG)的表达变化.结果:术侧DRG CGRP表达均明显增强,其中21 d组明显强于0 d组(P＜0.05);术侧脊髓后角CGRP免疫阳性面积明显增大,21 d组明显大于0 d组(P＜0.05),其CGRP表达在0 d、3 d和21 d组均强于对侧(P＜0.05),而3 d和21 d组又明显强于0 d组(P＜0.05);3d组脊髓前角的CGRP表达在明显强于0 d组和对侧(P＜0.05).结论:预变性处理可以影响CGRP的表达从而影响神经再生过程.
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大鼠坐骨神经缺损后不同时间修复的效果比较
目的 比较大鼠坐骨神经缺损不同延迟时间后修复的再生效果.方法 大鼠右侧坐骨神经缺损分别预变性0、3、7、14和21 d后,用对侧坐骨神经桥接,术后6周分别行快蓝(Fast blue)逆行荧光示踪、胫前肌湿重称量、再生轴突数目、直径及髓鞘厚度等检测.结果 预变性7 d组的再生轴突数目多、直径大、髓鞘厚,明显优于其他组;3 d组与0 d组无明显差别,14 d和21 d组相对较差.结论 不同延迟时间后修复神经缺损可以对神经再生效果产生不同的影响,以7 d时再生效果佳.
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预变性成年大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的培养
目的:对预变性大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的形态学及免疫组化进行研究,探讨获取自体激活嗅鞘细胞简单而实用的方法.方法:建立嗅神经切断模型,大鼠(12只)均在显微镜下暴露左侧嗅球,而预变性嗅神经组(6只)切断大鼠左侧嗅神经,3 d后取材采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅鞘细胞,在不同时间进行NGFRp75 免疫组化染色鉴定及形态学观察.结果:嗅鞘细胞发生代偿性肥大,数量及纯度高,此方法成功培养出自体激活的嗅鞘细胞.结论:预变性嗅神经是获取成年大鼠自体激活嗅球嗅鞘细胞的简单而实用的方法.
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预变性神经移植的时限
目的观察不同时限预变性神经.方法家兔36只分为6组,双侧腓总神经被切断,分别于0,4,7,14,21和28d取材从大体、组织学、免疫组织细胞化学、电镜等方面观察神经损伤后的变化.结果2wk预变性神经内膜管中空,雪旺细胞增生达高峰,基底膜成熟,近端神经瘤直径增粗达高峰.结论2wk是预变性神经移植的佳时限.
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体内预变性坐骨神经体外培养雪旺细胞
目的介绍一种快速、简便获取大量Schwann细胞培养方法.方法体内切断一侧坐骨神经,1、2、3、4 d及1、2周后取坐骨神经进行体外Schwann细胞培养.对侧不做任何处理的坐骨神经作为对照组.同时在培养液中加入刺激因子forskolin和BTI.结果体内预变性后Schwann细胞产量高于对照组3倍;加刺激因子forskolin和BTI后高于对照组5倍.预变性的佳时间为1周.结论这种体内预变性坐骨神经后再进行体外Schwann细胞培养不失为一种较好的实验方法.
