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雪旺细胞体外培养纯化的方法学研究进展
已知雪旺细胞在周围神经损伤后的修复过程中发挥关键作用,如何获得大量纯化的雪旺细胞已成为当前临床医学和基础毒理学领域的专家们所共同关注的现实问题.本文旨在概述目前国内外公认的体外培养纯化雪旺细胞的方法,比较其优缺点,为雪旺细胞的广泛应用提供一定的技术支持,同时也期望对其他神经细胞的培养提供方法学上的借鉴.
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雪旺细胞对丙烯酰胺致周围神经损伤后的修复
神经系统是丙烯酰胺(acrylamide,ACR)毒作用的重要靶点,亚急性中毒主要引起周围神经损伤.以往的研究多集中于神经元初始损伤位点的确定和损伤性形态学变化的描述,而对周围神经系统内数量众多的胶质细胞关注很少[1].
关键词： 丙烯酰胺 周围神经损伤修复 雪旺细胞 突触素-Ⅰ 突触小体相关蛋白-25 -
雪旺细胞在ACR对运动神经元损伤及修复过呈中的作用研究
目的 探讨雪旺细胞( Schwann cells,SCs)在丙烯酰胺(acrylamide,ACR)对运动神经元损伤及修复过程中的作用.方法 原代培养大鼠SCs,用插入式培养皿进行SCs与运动神经元VSC4.1的混合培养；噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度ACR对单独和混合培养运动神经元VSC4.1相对存活率的影响；细胞免疫荧光法检测ACR损伤和修复过程中运动神经元VSC4.1中生长相关蛋白43( growth-associated protein,GAP-43)水平的变化.结果 ACR染毒运动神经元VSC4.1 24 h,单独培养组的IC50为329μg/ml,混合培养的IC50为558μg/ml; GAP-43的水平较对照明显降低,混合培养组GAP-43的平均荧光强度(0.076±0.008)高于单独培养组(0.037±0.013),P＜0.05.VSC4.1染毒24h后去除ACR暴露并继续培养24h,GAP-43的水平较染毒24h时上升,混合培养组GAP-43的平均荧光强度值(0.241±0.033)高于单独培养组(0.143±0.034),P＜ 0.05.结论 ACR对运动神经元VSC4.1具有明显的毒性作用,SCs对ACR所致运动神经损伤具有保护作用,同时对损伤后修复过程发挥一定的促进作用.
关键词： 雪旺细胞 丙烯酰胺 运动神经元VSC4.1 生长相关蛋白43 -
筋脉通对高糖培养雪旺细胞炎性因子及神经营养因子的影响
目的 探讨中药筋脉通(JMT)对高糖条件下雪旺细胞(SCs)炎性因子及神经营养因子蛋白表达的影响.方法 将雄性SD大鼠随机分为3组,分别以筋脉通胶囊、神经妥乐平(Ntp)及等体积蒸馏水灌胃制备含药血清和正常大鼠血清;原代培养SCs,分为正常组、高糖组、JMT组和Ntp组,48 h后用CCK-8法检测各组SCs细胞增殖,免疫印迹法检测各组SCs细胞IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、NGF及NT-3蛋白的表达,夹心法酶联免疫吸附法测定各组SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的表达.结果 与正常组比较,高糖组SCs增殖活性减低(P＜0.01),TNF-α蛋白表达上调、分泌量增加(P＜0.05),IL-1β、L-10蛋白表达上调(P ＜0.05,P＜0.01),NGF的蛋白表达下调、分泌量减少(P ＜0.05,P＜0.01),NT-3蛋白表达下调(P＜0.05).与高糖组比较,JMT组细胞增殖活性提高(P＜0.01),TNF-α蛋白表达量及分泌量减少(P＜0.05),IL-1β、L-10蛋白表达量减少(P＜0.01),NGF蛋白表达量、分泌量及NT-3蛋白表达增加(P ＜0.05);JMT组SCs细胞增殖活性提高,SCs中TNF-α表达及分泌受到抑制,IL-1β表达量减少,NGF蛋白表达增加,其作用优于Ntp组(P＞0.05,P＜0.01).IL-6蛋白表达和分泌在各组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 JMT含药血清能够提高高糖培养SCs的增殖活性,降低TNF-α、IL-1β、L-10等炎性因子表达,抑制TNF-α分泌,提高NT-3表达,促进SCs分泌NGF,从而起到防治DPN的作用.
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槲皮素通过自噬途径减轻高糖致体外培养RSC96细胞的损伤
目的：观察槲皮素对高浓度葡萄糖培养的大鼠雪旺细胞系细胞( rat Schwann cell line,RSC96)自噬、增殖活性和凋亡的影响。方法高浓度葡萄糖(125 mmol/L)及槲皮素(25μmol/L)离体培养RSC96细胞,作用72小时后,噻唑基四唑( methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖活性,原位末端标记法[ terminal dexynucleotidyl transferase( TdT)-mediated dUTP nick end labe-ling,TUNEL]评价凋亡,Western blot法检测caspase-9活化的P35亚基、caspase-3活化的P20亚基及自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达。结果高糖抑制离体培养的RSC96细胞的增殖活性,吸光度(optical density,OD)值降低,凋亡率增加,P35亚基、P20亚基蛋白表达上调(P<0．05,P<0．01)；槲皮素能够增加高糖培养RSC96细胞的增殖活性,下调P35、P20蛋白表达及凋亡率( P<0．05,P<0．01)。然而当自噬被抑制后,槲皮素上述保护作用则被削弱,细胞死亡增多(P<0．01)。结论槲皮素通过增加自噬以促进RSC96细胞的增殖、减少凋亡,从而减轻高浓葡萄糖的损伤。
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芍药内酯苷对大鼠坐骨神经雪旺细胞的保护作用研究
目的:探讨糖痹康颗粒中主要成分芍药内酯苷对大鼠坐骨神经雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)的影响作用.方法:本实验通过不同浓度的葡萄糖对大鼠坐骨神经雪旺细胞的影响的研究,建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖,培养时间为48 h的细胞氧化应激模型,通过设立芍药内酯苷高中低组(100 μM、20μM、4μM),模型组,维生素C组(100μM),正常组,利用流式细胞仪定量检测细胞内ROS含量和荧光显微镜定性观察细胞内ROS状态以及CCK-8检测细胞活性.结果:采用CCK-8法检测细胞增殖情况,48 h后,模型组与正常组有明显的差异P＜0.01;芍药内酯苷给药组与模型组相比,P＜0.01;芍药内酯苷可以促进雪旺细胞增殖.通过检测ROS荧光含量,发现芍药内酯苷100、20、4μM与模型组(Glu 150 mM)相比,各组P＜0.01,表明芍药内酯苷可以减轻雪旺细胞内ROS,缓解氧化应激状态.结论:芍药内酯苷可以通过增加雪旺细胞增殖,改善氧化应激状态对雪旺细胞产生保护作用.
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中药筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞NF-κB表达的影响
目的 观察中药筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞(SCs)中NF-κB蛋白及其mRNA表达的影响.方法 原代培养并纯化Wistar乳鼠坐骨神经SCs,蛋白S-100免疫组织化学法进行鉴定.取第3代SCs,加入不同培养基,分为正常组、高糖组、筋脉通组和神经妥乐平组进行培养,48 h后采用激光扫描共聚焦显微技术检测NF-κB蛋白的表达,实时荧光定量PCR技术检测NF-κB mRNA的表达.结果 正常组NF-κB绿色荧光强度较弱,主要表达于胞浆区;高糖组荧光强度于胞浆区和胞核区表达都较正常组增强;筋脉通组和神经妥乐平组表达都较高糖组减弱,主要表达于胞浆区.高糖组SCs中NF-κB的蛋白及其mRNA表达较正常组明显增强(P＜0.01);与高糖组比较,筋脉通组和神经妥乐平组NF-κB的蛋白及其mRNA的表达显著下降(P＜0.01).结论 筋脉通含药血清可抑制高糖培养SCs中NF-κB蛋白及其mRNA的表达.
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坐骨神经创伤性华勒氏变性中雪旺细胞凋亡初步研究
目的:探讨成年大鼠坐骨神经创伤性华勒氏变性中雪旺细胞凋亡的存在及其时相性变化规律.方法:利用成年雌性SD大鼠坐骨神经横断复制华勒氏变性模型.将74只SD大鼠随机分为12组.1个正常组(8只)、11个实验组(66只).每只实验组大鼠双后肢再随机分为试验肢(构成试验组)和对照肢(构成对照组).分别于术后1 h,6 h,12 h,24 h,2 d,3 d,4 d,8 d,14 d,21 d,30 d共11个时相点,切取坐骨神经中下段标本.检测各组神经纤维形态学改变,雪旺细胞S-100蛋白和凋亡基因相关产物Bcl-2、Fas、Bax表达水平变化,并用TUNEL法检测雪旺细胞凋亡指数.结果:①试验组雪旺细胞数量术后24 h开始明显减少,术后8 d才开始重新增多.②S-100蛋白表达对照组变化无统计意义(P＞0.05),试验组则在术后1 h,21 d两个时间点变化有统计意义(P＜0.05).③雪旺细胞凋亡抑制基因产物Bcl-2表达,正常组双侧肢变化无差异(P＞0.05),而对照组术后6 h明显升高,术后24 h、4 d、21 d轻度增高(P＜0.01),试验组术后6 h,24 h,8 d,14 d,30 d进行性升高(P＜0.01).④雪旺细胞凋亡促进基因产物Bax表达,正常组双侧肢比较无差异(P＞0.05),而对照组术后6 h,3～21 d持续高表达(P＜0.01),试验组14 d开始进行性上升(P＜0.01).⑤雪旺细胞凋亡促进基因产物Fas表达,正常组双侧肢比较无差异(P＞0.05),对照组仅轻度增高(P＞0.05),而试验组术后12 h开始进行性升高(P＜0.01).⑥TUNEL法凋亡试剂盒原位检测显示正常组雪旺细胞凋亡发生率极低,双侧肢比较无差异(P＞0.05);试验组分别在术后6 h,24 h,2 d,21 d出现大量雪旺细胞凋亡阳性核(P＜0.01),高峰出现在华勒氏变性早期.结论:成年大鼠坐骨神经横断后,远侧段创伤性华勒氏变性早期存在雪旺细胞凋亡高峰.并且雪旺细胞凋亡的发生,及凋亡相关促进基因Bax、Fas和抑制基因Bcl-2的表达均具有特定的时相性变化特点.
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糖络宁对DPN大鼠和雪旺细胞内质网应激PERK通路的影响
目的:观察糖络宁对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠和雪旺细胞内质网应激RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)通路相关蛋白和mRNA表达的影响.方法:60只SD雄性大鼠,除空白组外,其余各组大鼠采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ,35 mg·kg-1)复制DPN大鼠模型,随机分为模型组,氧化三甲胺组,糖络宁低、高剂量组,连续给药12周.采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠坐骨神经病理学改变,免疫荧光染色法检测大鼠坐骨神经中p-PERK,磷酸化的真核翻译起始因子2a (p-eIF2a)和转录活化因子4(ATF4)蛋白的表达;建立高糖诱导的雪旺细胞模型,分为25 mmol·L-1葡萄糖组(control),150 mmol·L-1葡萄糖组(model),150 mmol·L-1葡萄糖+0.1％,1％和10％糖络宁组,分别干预24,48 h.采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测细胞中PERK,核转录因子E2相关因子2(Nrf2),血红素加氧酶-1(HO-1),B淋巴细胞瘤-2相关的X蛋白(Bax)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达水平.结果:坐骨神经病理学改变:空白组大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘结构完整致密,形态规则,排列整齐.模型组出现严重脱髓鞘现象,结构松散,形态不规则,排列紊乱.糖络宁组有轻微脱髓鞘现象,结构近似完整,形态近似规则.经积分吸光度统计,与空白组相比,模型组明显降低(P＜0.01);雪旺细胞PERK,Nrf2,HO-1,Caspase-3和Bax mRNA表达水平,与空白组比较,同时相的模型组中PERK,Bax和Caspase-3 mRNA的表达明显升高(P ＜0.05,P＜0.01),与模型组比较,同时相的糖络宁3个含药血清剂量组中以上3个指标表达明显降低(P ＜0.05,P＜0.01),而Nrf2和HO-1 mRNA的表达明显升高(P＜0.05,P＜0.01);坐骨神经中p-PERK,p-eIF2a和ATF4蛋白表达,与空白组比较,模型组蛋白表达量显著增加(P＜0.01);与模型组比较,糖络宁组蛋白表达量显著减少(P＜0.01).结论:糖络宁能够减轻坐骨神经组织的病理损伤,其防治DPN的作用机制可能与调节内质网应激时PERK相关途径包括抑制PERK/eIF2a途径同时促进PERK/Nrf2途径有关.
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糖痹康对高糖培养雪旺细胞自噬相关蛋白的影响
目的:研究发现细胞自噬是糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)的重要发病机制之一,本研究探讨治疗DPN的中药复方糖痹康(Tangbikang,TBK)对高糖环境下大鼠雪旺细胞(rat Schwann cells,RSC)自噬相关蛋白的影响.方法:利用SD大鼠制备TBK含药血清,并采用50mmol·L-1的葡糖糖(Glu)RSC细胞培养基制备高糖RSC细胞模型.实验总共分为6组:正常组(Con,20％正常大鼠血清),高糖组(Glu,50mmol·L-1Glu+20％正常大鼠血清);弥可保组(MKB,50mmol·L-1Glu+20％弥可保含药血清);TBK高剂量组(TBKH,50mmol·L-1Glu+20％ TBK含药血清);TBK中剂量组(TBKM,50mmol·L-1Glu+10％ TBK含药血清+10％正常大鼠血清);TBK低剂量组(TBKL,50mmol·L-1Glu+2.5％ TBK含药血清+17.5％正常大鼠血清).干预48 h后,采用细胞增殖实验细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RSC细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬蛋白(Beclin 1)和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3 Ⅱ)的表达水平.结果:与Con 组比较,高糖因素使得Glu组RSC增殖活性显著降低(P <0.01),细胞凋亡率显著增加(P <0.01),且自噬相关标志蛋白Beclin 1和LC3 Ⅱ显著下降(P<0.01);与Glu组比较,MKB组与TBKH组RSC细胞增殖显著减弱(P<0.01),MKB组,TBKH和TBKM组RSC细胞凋亡率显著减小(P<0.01),MKB组和TBKH组RSC细胞自噬标志蛋白Beclin 1和LC3 Ⅱ的表达水平显著升高(P<0.01).结论:TBK能够促进高糖环境下RSC细胞自噬,减少凋亡,具有一定的神经保护作用,该研究为DPN新药研发奠定基础.
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中药筋脉通对高糖培养雪旺细胞增殖及NGF表达的影响
目的:从细胞生物学水平观察筋脉通含药血清对高糖培养雪旺细胞(SC)的增殖及其分泌神经生长因子(NGF)的影响.方法:体外培养大鼠SC,采用血清药理学方法制备筋脉通含药血清,观察筋脉通含药血清对高糖培养SC增殖活性的影响,检测筋脉通含药血清对高糖培养SC分泌NGF的影响.结果:高糖培养条件下,SC增殖及分泌NGF的能力明显减弱,筋脉通含药血清可增强高糖培养SC的增殖能力,上调NGF的表达水平,作用与神经妥乐平含药血清相似.结论:中药筋脉通可有效促进高糖环境培养的SC的增殖能力及其分泌NGF的水平.
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糖痹康对高糖环境下大鼠雪旺细胞p38MAPK、TNF-α及sVCAM-1表达的影响
目的:观察中药复方糖痹康对高糖环境下大鼠雪旺细胞p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及可溶性血管间内皮细胞黏附分子-1(sVCAM-1)表达的影响.方法:通过雪旺细胞株,建立高糖环境下大鼠雪旺细胞的细胞模型;用不同剂量的含药血清和正常血清培养基刺激48h后,采用放免法检测细胞上清中TNF-α的含量;ELISA法检测细胞上清中sVCAM-1的含量,Western blot法检测大鼠雪旺细胞p38和磷酸化p38丝裂素活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)的表达.结果:与空白对照组比较,高糖对照组的sVCAM-1、TNF-α、p-p38 MAPK及p-p38 MAPK含量显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与高糖对照组比较,弥可保与糖痹康各剂量组上清中sVCAM-1、TNF-α、p38 MAPK及p-p38 MAPK的含量显著降低(P＜0.05,P＜0.01).结论:糖痹康含药血清可下调在高糖环境下大鼠坐骨神经雪旺细胞p38 MAPK及其激活形式p-p38 MAPK蛋白表达,下调大鼠坐骨神经雪旺细胞上清中TNF-α的含量,可能是其DPN神经保护及镇痛作用靶点之一及下调大鼠坐骨神经雪旺细胞上清中sVCAM-1的含量,可能是其DPN神经保护作用靶点之一.
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红景天提取物烯苷对高糖条件下离体雪旺细胞活力和增殖能力变化的影响
目的 观察高糖培养条件下离体雪旺细胞活力和增殖能力的变化以及中药红景天提取物烯苷对该变化的影响, 探讨糖尿病性周围神经损伤和药物作用的可能机制.方法 采用Bockes改良法从新生Wistar乳鼠坐骨神经组织分离纯化雪旺细胞;采用XTT法测定雪旺细胞活力:采用3H-TdR掺入法检测雪旺细胞的增殖能力.结果 高糖对离体雪旺细胞活力和增殖能力具有显著抑制作用;烯苷对高糖导致雪旺细胞增殖能力的抑制性变化具有显著的改善作用.结论 烯苷改善高糖条件下离体雪旺细胞增殖能力的抑制性变化,为中药红景天临床治疗糖尿病性周围神经损伤提供了进一步的实验依据.
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筋脉通含药血清降低高糖培养大鼠雪旺细胞活性氧水平及PARP-1蛋白表达
目的 研究筋脉通含药血清对体外高糖培养雪旺细胞活性氧(ROS)水平及多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)蛋白表达的影响.方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组,分别灌胃筋脉通(JMT)、维生素C(VC)或蒸馏水制备含药血清和对照血清.取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备雪旺细胞,分为高糖组、JMT组(加入筋脉通含药血清)、VC组(加入维生素C含药血清)及正常对照组.培养48 h后,采用激光扫描共聚焦显微技术检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平；采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞PARP-1(89 ku)的蛋白表达.结果 1)高糖组雪旺细胞ROS-DCF荧光值(86.59 ±8.14)显著高于正常值(P＜0.01)；筋脉通含药血清组(44.58±8.67)与维生素C含药血清组(46.12±8.80)均显著低于高糖组(P＜0.01).2)与正常组比较,高糖组雪旺细胞内PARP-1(89 ku)含量(0.712 ±0.012)明显增加(P＜0.01)；与高糖组比较,筋脉通含药血清组含量(0.307±0.025)明显降低(P＜0.01),且明显优于维生素C组(0.594±0.017) (P ＜0.01).结论 筋脉通含药血清能显著减少ROS生成,降低PARP-1的活性和酶解,减轻细胞DNA氧化损伤.
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筋脉通含药血清对高糖培养大鼠雪旺细胞β-catenin、GSK-3β及髓鞘零蛋白表达的影响
目的探讨不同浓度筋脉通含药血清对高糖培养大鼠雪旺细胞(SCs)β-catenin、GSK-3β及髓鞘零蛋白(P0)的影响. 方法SD大鼠灌胃获得含药血清及正常血清,原代培养雪旺细胞,随机分为正常对照组、高糖组、筋脉通5、10和20倍干预组,72 h后分别用CCK、real-time PCR和Western blot法检测各组SCs细胞增殖活性及β-catenin、GSK-3β和P0的mRNA与蛋白表达.结果与正常组相比,高糖组SCs细胞增殖率显著降低(P<0.01),β-catenin和P0 mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.01),而GSK-3β mRNA表达显著上升(P<0.05).中药筋脉通干预后使高糖培养的SCs细胞β-catenin、P0的mRNA及蛋白表达显著回升(P<0.01),而GSK-3β mRNA表达显著回降(P<0.01),且与浓度相关.结论高糖可引起SCs细胞损伤,中药筋脉通可以通过调节β-catenin、GSK-3β水平抑制该作用.
关键词： 筋脉通 雪旺细胞 Wnt/β-catenin 髓鞘零蛋白 -
高浓度葡萄糖通过下调自噬增加体外培养雪旺细胞的凋亡
目的 观察高浓度葡萄糖对雪旺细胞自噬活性的影响以及自噬对高糖条件下雪旺细胞增殖活性及凋亡的影响.方法 体外培养RSC96细胞,Western blot和免疫荧光法检测beclinl和caspase-3蛋白表达,MTT检测细胞增殖活性.结果 高浓度葡萄糖组RSC96细胞beclin1的表达减少(P＜0.05),细胞增殖活性降低(P ＜0.05,P＜0.01).自噬被抑制后加剧了高糖对细胞增殖活性的削弱作用(P＜0.01),同时增加了高糖促进caspase-3的活化作用(P＜0.01).结论 高浓度葡萄糖通过下调自噬活性增加细胞凋亡.
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高糖对体外培养雪旺细胞影响的研究进展
雪旺细胞在糖尿病周围神经病变过程中起着重要的作用,近年来伴随组织细胞体外培养技术的日趋成熟,探讨体外高糖环境对雪旺细胞的影响逐渐成为研究新热点.本文就近年来高糖环境对体外培养雪旺细胞影响的相关研究作一综述.
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复合bFGF及肝素的外周神经桥接体在神经修复中的作用
目的:探讨bFGF和肝素与外周神经桥接体复合后在兔正中神经缺损修复中的作用.方法:成年雄性新西兰兔48只,建立左侧上臂正中神经30mm缺损.随机分为4组,分别用不同神经桥接体修复神经缺损,即A组为去细胞基膜管种植雪旺细胞并复合bFGF及肝素的桥接体、B组为去细胞基膜管种植雪旺细胞的桥接体、C组为去细胞基膜管复合bFGF及Hep桥接体、D组为自体神经作为对照.于术后1月、3月分别取材行HE及Masson's三色染色,光镜观察神经再生、神经内胶原纤维形成及血管形成;3月检测各组桥接体运动神经传导速度,并行透射电镜检查,称量指浅屈肌肌肉湿重,观察神经功能恢复.结果:复合bFGF及肝素的桥接体组(A组、C组)神经再血管化及神经胶原形成与自体神经差异无统计学意义(P＞0.05),与B组比差异有显著统计学意义(P＜0.01).A组神经再生数据(再生有髓神经纤维密度、平均髓鞘厚度、有髓纤维直径及运动神经传导速度、肌肉湿重恢复率)与自体神经移植(D组)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:bFGF及肝素用于组织工程神经桥接体修复神经缺损,能提高神经桥接体再血管化水平,减少胶原纤维形成,促进轴突生长有利于神经再生质量的提高.
关键词： 外周神经损伤 组织工程 去细胞神经基膜管 碱性成纤维细胞生长因子 雪旺细胞 -
雪旺细胞分步消化培养及其纯化实验研究
目的:探讨双酶分步消化法从乳兔周围神经中分离培养雪旺细胞,以及纯化获得高纯度的雪旺细胞的方法.方法:采用出生1周内乳兔的坐骨神经,先用胰蛋白酶消化分离出一部分细胞,移出后,再予胶原酶消化分离其余的细胞,计算上两步消化后的活细胞的百分率,另外采用:(1)无任何处理;(2)单纯双30min差速贴壁;(3)Ara-c;(4)Geniticin纯化法,以及后3种方法联合应用进行纯化,计算雪旺细胞的纯度.结果:采用分步消化法所得到的活细胞百分率分别为96.5%以上和95%以上,无任何处理的雪旺细胞纯度为85%,单纯双30min差速贴壁纯度为90%,Ara-c纯化的纯度为91%,Geniticin纯化的纯度为95%,(2)、(3)、(4)方法的联合应用纯化的纯度为98%.结论:双酶消化法和联合应用双30min差速贴壁、Ara-c、Geniticin纯化是获取高纯度雪旺细胞的理想方法.
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大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学研究
目的:观察采用化学萃取法和反复冻融法制备大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学变化.方法:雌性Sprague-Dawley鼠坐骨神经16条随机分为化学萃取法(chemical extracted nerve,CEN)和冻融法(freeze-thawed nerve,FTN)两组,每组18条.分别予Trinton-100化学萃取、-196℃～20℃反复冻融处理后,光镜、电镜观察其组织、形态学变化.结果:(1)CEN组基膜管管壁完整、贯通,无细胞结构,可见管状神经轮廓.(2)FTN组基膜管管壁破损、管腔堵塞,轴突、髓鞘、雪旺细胞及小血管变性、坏死,可见大量细胞碎片.结论:两种方法均能保持周围神经正常的三维空间结构,CEN制备的周围神经去细胞基膜管更具有组织形态学优势.
