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一起成人轮状病毒腹泻流行的调查
淄博市黑旺村1990年1月22日至4月24日发生一起成人轮状病毒腹泻流行,发病233人(17.12%),年龄以40～49岁(20.50%)和30～39岁(20.26%)组为高、男女之比1∶1.03.病程平均为4.63天,腹泻持续天数平均为3.64天,平均潜伏期3.15天.直接电镜观察急性期病人粪便标本,发现直径为70～80nm大小的轮状病毒颗粒及降解直径为40～60nm的病毒核心,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果为成人轮状病毒.本次流行经调查证明与修建房屋时集中聚餐有关.
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茎瘤芥新鲜种子总RNA提取研究
为了探讨茎瘤芥新鲜种子内RNA的总含量,先用过氧化氢进行消毒预处理,再用浓度为0﹑5、10、20 mg/L的硫酸铜溶液对预处理好的种子在25 ℃下进行浸种处理,每一种浓度的溶液均对种子进行4 h、8 h、12 h处理,后利用CTAB法提取RNA,采用CTAB作为去污剂,分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及LiCl沉淀,以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质,后用无水乙醇沉淀获得总RNA在提取RNA后经过凝胶电泳得出一系列不同宽度和亮度的条带,分析RNA的含量,再经过核酸蛋白分析仪分析波长,分析出RNA的纯度,从而明确茎瘤芥新鲜种子的总RNA含量.
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葡萄糖介质中铬(V)化合物诱导DNA损伤的机理探讨
目的初步探索铬[Cr(V)]中间化合物在葡萄糖介质中对DNA损伤的反应机理.方法共研究了在4种糖类及3种不同pH值条件下DNA损伤的情况.DNA的损伤通过凝胶电泳测定;反应体系中各物种的寿命及新物种的测定用顺次共振波谱仪检测.结果Cr(V)在葡萄糖介质中具有毒性并可能导致癌症,但不同糖类对DNA的损伤不同,同时随着pH值的增高,DNA的损伤相对较小,这是由于反应体系的酸性增加,Cr(V)化合物发生歧化反应的速度加快以及还原剂氢原子浓度的增加所造成的,同时Cr(V)化合物与葡萄糖产生配位体交换使反应体系产生新的物种,而新物种对DNA也产生损伤.结论根据实验结果初步推断葡萄糖介质中铬(V)化合物诱导DNA损伤的机理.
关键词： 铬(Cr(V))中间化合物 DNA损伤 凝胶电泳 顺磁共振波谱仪 -
传统凝胶电泳与Experion全自动电泳系统的比较
凝胶电泳作为一种技术出现,已有近百年的历史,但真正被视为一种在生命科学中有重要意义的技术,是由1937年A.Tiselius首先提出.传统凝胶电泳由于存在操作步骤烦琐和重复性不好的缺点,经历了向预制胶、高通量电泳槽的发展过程,但并未从根本上改变传统凝胶电泳的不足.人们认识到只有采用完全全新的电泳技术才有可能克服其不足.
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补体C3在男性不育患者血浆蛋白中的差异分布
目的:分析男性不育患者与正常捐精者血浆蛋白含量的差异.方法:利用低浓度的聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离10例正常捐精者和2例不育症男性患者的血浆蛋白,对差异蛋白条带进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定,继而对142例不育男性患者血浆进行分析.结果:男性不育患者与正常捐精者血浆蛋白SDS-PAGE电泳结果显示,在分子量约为200kD及120kD处出现了两条明显的蛋白差异条带,经鉴定为补体C3.对所有144例不育患者的血浆蛋白分离验证结果表明,同时出现这两条差异条带的有135例(93.75%).结论:补体C3在男性不育患者与正常捐精者血浆中存在蛋白形式差异,该差异在不育患者中的生物学意义有待进一步研究.
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人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是引起尖锐湿疣甚至癌变的病原体.PCR技术检测病毒DNA序列具有特异、敏感等特点,但对仪器设备及检测人员技术要求较高,不适合于基层医疗单位临床实验室的常规诊断方法.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术针对靶基因6个区域设计4条特异引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下完成扩增,扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测,具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点.国内外利用LAMP技术检测HPV的方法研究偶有报道[1-2],但针对HPV-6和HPV-11成功的方法研究未见文献报道.
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不同组织DNA提取的比较
分子生物学技术应用于病理学不仅能辅助诊断,而且在评估预后及指导治疗方面也具有重要作用.DNA提取是分子病理诊断和相关科研中的关键步骤.提取高质量的DNA除了需要操作者的经验、高质量的试剂盒以外,组织的来源也很重要.对于病理科常用的甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)组织来讲,往往不同组织来源的DNA质量存在显著差异,是制约后续分子病理检测的重要因素.本文对比检测了不同组织来源DNA的浓度和质量,并加以总结分析.
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免疫印迹法检测抗ENA抗体结果分析
抗ENA抗体是针对核内可提取性核抗原(ex-tractable nuclear antiger,ENA)的一种自身抗体.不同的自身免疫性疾病其抗ENA抗体阳性率有明显差异,有的特异性很高.本组对疑为自身免疫性疾病、风湿病患者采用免疫印迹法(IBT)检测抗ENA多肽抗体.该法将凝胶电泳、蛋白质转运、分子亲和技术、酶免疫测定融为一体,可一次性测定抗Sm、抗U1-RNP 、抗SS-A、抗SS-B、抗Jo-1、抗ScL-70和抗核抗体等7种多肽抗体,较传统的对流免疫电泳法(CI-ET)具有特异性强、灵敏度高、简便等优点.
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四种分析技术检测血清单克隆免疫球蛋白的比较
单克隆免疫球蛋白( monoclonal immunoglobulin)即M蛋白,是由单克隆浆细胞分泌的异常免疫球蛋白,常在浆细胞病如多发性骨髓瘤、Waldenstr(o)n巨球蛋白血症和原发性淀粉样变性等患者血中出现.目前,免疫固定电泳被认为是分析和鉴定M蛋白的灵敏的方法.高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是20世纪80年代迅速发展起来的一种新技术,与传统的凝胶电泳相比,其分辨率高,结果重现性好,分析快速.
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核转录因子Sp1在手术创伤后腹膜组织中的表达和意义
目的:探讨人核转录因子Sp1在手术创伤后腹膜组织中的活性改变与腹膜粘连形成之间的关系.方法:采用凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测手术创伤后不同时间的人腹膜组织核转录因子Sp1表达水平.Masson 染色观察腹膜组织中胶原纤维的变化.结果:手术创伤后30 min核转录因子Sp1被活化,随着手术时间延长,Sp1在创伤腹膜组织中的表达水平逐渐升高,存在差异显著性(P＜0.01).随手术时间的延长腹膜组织中胶原纤维增加.结论:核转录因子Sp1的活化对于腹膜粘连形成具有一定的作用.
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复方利肝冲剂药物血清对肝星状细胞NF-KB结合活性的抑制作用
目的:研究复方利肝冲剂对肝星状细胞NF-κB结合活性的影响,探讨复方利肝中剂抗肝纤维化的主要作用机制.方法:复方利肝冲剂药物血清与鼠肝星状细胞共孵育48h后,NF-kB结合活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA去,细胞凋亡和细胞增殖分别采用流式细胞术和3H-TdR掺入法检测结果:复方利肝中剂药物血清使长外培养的鼠肝星状细胞NFkB结合活性比无药血清对照组显著减弱(图1),细胞培养液中的IL-6和sJCAM水平降低(1.56±0.42ng·L-1vs3.64±0.58ng·L-1.P<0.05;3 82±0.98ng·L-1vs12.64±1.22ng·L-1,P<0.01)星状细胞凋亡增加24.8%± 3.60%vs6.6%± 1.2%,P<0.01,增殖减少2623±654/孔vs5061±346/孔,P<0.01.结论:复方利肝中剂显著抑制体外培养的肝星状细胞NF-κB结合活性,可能为其抗纤维化的重要机制之一.
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幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系
目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pyroli)外膜和甲硝唑的结合作用与耐药性的关系.方法:运用亲和黏附酶反应法,观察H.pylori外膜和甲硝唑结合作用,并对比敏感菌和耐药菌与甲硝唑结合作用的差异:运用甲硝唑亲和层析柱和SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳对比敏感菌和耐药菌的甲硝唑结合蛋白.结果:H.pylori外膜存在甲硝唑的特异性结合位点,其结合作用能被高浓度甲硝唑竞争性抑制(P<0.001),耐药菌外膜与甲硝唑的结合作用明显低于敏感菌(P=0.0012).结论:H.pylori外膜对甲硝唑结合作用降低与甲硝唑耐药性的产生有关.
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端粒酶在大肠癌细胞中的活性表达及临床意义
目的:探讨端粒酶活性的改变在大肠癌发生发展过程中的作用以及端粒酶活性检测作为一种新的大肠癌临床诊断的生物学标志的可行性.方法:采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)结合聚酰胺凝胶电泳银染法检测46例配对大肠癌及癌旁组织,4例大肠癌肝转移病灶组织内端粒酶的活性,并用Southem-blot-ECL(enhanced chemiluminescecce)法对上述标本内端粒酶平均长度进行检测.结果:肿瘤组内端粒酶活性明显高于对应癌旁组织,在肿瘤组织内,端粒酶的活性表达升高与大肠癌的病理学分期呈显著相关性(P＜0.01,t=8.3477),而与肿瘤的大小、部位,肿瘤的恶性程度、分级、浸润深度、CEA表达水平等无显著相关性,与肿瘤组相比,在肝转移病灶内,端粒酶的活性表达无显著升高,肿瘤组内的端粒酶平均长度明显大于对应的癌旁组织.端粒酶平均长度与大肠癌的病理学分期呈显著相关性.结论:端粒酶的活化及其长度的缩短可能成为早期检测大肠癌癌变的临床指标.
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脂肪酸合成酶抑制剂抑制人胃癌细胞增生并诱导凋亡
目的:研究脂肪酸合成酶(FAS)抑制剂cerulenin对人胃癌细胞株增生的影响及诱导凋亡的作用.方法:MTT法观察终浓度2.5,5,10,20和40mg/Lcerulenin分别作用于无血清培养及含血清培养MKN28,SGC7901和MKN45细胞株24 h后,检测其对细胞增生的抑制作用.40 mg/L cerulenin作用于无血清培养的三种细胞12 h后,用流式细胞仪(FCM)、DNA凝胶电泳对其凋亡和细胞周期进行检测.结果:Cerulenin对人MKN28,SGC7901,MKN45细胞株的增生有显著的抑制作用并呈剂量依赖性,对无血清培养细胞株的抑制作用高于有血清组.2.5,5,10,20和40mg/Lcerulenin作用于有血清培养及无血清培养MKN28细胞24 h的抑制率分别为3.2±0.6%,7.3±0.5%,11.3±0.7%,17.7±1.2%,41.7±1.0%和5.1±1.3%,11.1±1.7%,20.9±1.3%,31.3±2.3%,60.2±3.9%,分别与其对照组比较有显著差异(1.4±1.3%,3.3±2.0%,6.2±3.2%,8.1±1.1%,10.1±1.7%,P＜0.05和2.8±1.1%,6.1±0.8%,8.5±1.3%,11.5±0.9%,17.2±2.2%,P＜0.05).2.5,5,10,20和40 mg/L cerulenin作用于有血清培养及无血清培养SGC7901细胞24 h的抑制率分别为3.4±0.8%,9.5±1.2%,23.3±1.7%,38.5±1.8%,65.2±2.1%和6.6±0.9%,14.3±2.1%,33.0±1.8%,56.9±2.2%,78.2±1.4%,与对照组比较有显著差异(2.3±1.0%,5.0±1.2%,7.3±1.0%,9.7±1.9%,13.4±1.3%,P＜0.05和3.9±1.2%,8.7±1.5%,10.5±1.9%,13.8±1.6%,19.5±1.7%,P＜0.05).2.5,5,10,20和40 mg/Lcerulenin作用于有血清培养及无血清培养MKN45细胞24h的抑制率分别为5.9±1.1%,13.5±0.9%,30.5±1.9%,49.1±1.5%,71.7±2.0%和8.4±1.1%,19.6±1.4%,40.4±1.4%,67.0±1.3%,83.8±2.0%,与对照组比较有显著差异(2.7±1.4%,7.4±1.1%,9.6±1.3%,12.6±1.1%,16.7±2.2%,P＜0.05和4.4±1.6%,9.5±0.9%,13.7±0.7%,18.4±1.6%,26.6±2.1%,P＜.05).Cerulenin作用无血清培养MKN28,SGC7901,MKN45细胞株24 h的IC50值分别为13.3 mg/L,16.7 mg/L,32.3 mg/L显著低于含血清组(20.1 mg/L,26.6 mg/L,46.3 mg/L,P＜0.01).MKN28,SGC7901,MKN45细胞在Cerulenin(40 mg/L,12 h)作用下,凋亡率分别为10.1±0.7%,12.5±0.4%,14.9±0.8%,与对照组比较有显著差异(1.0±0.2%,0.9±0.5%,0.9±0.7%,P＜0.01),并引起胃癌细胞发生G2/M期阻滞.DNA凝胶电泳出现梯状条带.结论Cerulenin显著地阻遏人胃癌细胞的增生并诱导人胃癌细胞凋亡,是胃癌治疗的新靶点.
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前列腺癌患者外周血中前列腺特异性膜抗原mRNA的表达
采用巢式RT-PCR方法检测33例前列腺癌(PCa)患者外周血中前列腺特异性膜抗原(PSM) mRNA的表达,报告如下.材料与方法 43例患者分2组:(1)PCa组:33例,其中B期9例,C期20例,D期4例,均经前列腺穿刺病理证实.21例接受过黄体生成素释放激素类似物(LHRH)治疗.(2)良性前列腺增生(BPH)组:10例,经TURP术后病理证实.取患者静脉血5 ml,Ficoll分离白细胞,提取RNA,逆转录cDNA,巢式PCR扩增,扩增产物用凝胶电泳观察,测序鉴定PCR结果.统计学方法采用χ2检验,χ2=35.85.
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皮肤磨削术前后组织中KGF mRNA的表达
皮肤磨削术在临床上有着较广泛的应用，但是其创面修复的机理至今尚未完全阐明。角质形成细胞生长因子(KGF)由Rubin等在1989年分离鉴定［1］，它特异性地作用于上皮细胞，促进其生长增殖和分化，因而探讨其在术后创面上皮再生过程中的作用很有意义。我们抽提了12例患者手术前后皮肤组织中的总RNA进行RNA印迹法(Northern blot)，结果如下。 一、对象和方法 1.对象：为我科住院病人，供皮区为选磨削术野中较大面积的瘢痕区域，3个月内未患任何皮肤疾患；年龄21～34岁，均为男性；痤疮瘢痕9例，水痘瘢痕2例，外伤性瘢痕1例；病程5～12年。取材方法：标本为全层皮肤，分别在术前和术后24、72、120 h 以切口为中心取全层皮肤，标本离体后立即置液氮中保存，实验前去除缝线用电子天平计重。 2.方法:①试剂：Trizol: Gibco公司产品； Agarose, Prime -α-Gene Labeling System:Promega公司产品。②人KGFcDNA探针的制备：人KGFcDNA片段由中国人民解放军烧伤中心实验室惠赠，含有人KGFcDNA全长585bp中的345bp。③方法：所有标本按文献［2］进行总RNA抽提，吸取l0 μg总RNA(约4.5 μl)，加入2.0 μl 5X甲醛凝胶电泳缓冲液、3.5 μl 37 %甲醛和10.0 μl甲酰胺，在65℃温育15 min，进行甲醛变性凝胶电泳，在20XSSC中经真空转移0.5 h至尼龙膜上，尼龙膜晾干后在80℃烘烤0.5～2h固定，用6XSSC、2XDenhardt和1 %SDS在68℃预杂交1～2 h后，将用α-32P-dATP标记的人KGFcDNA探针加入杂交管在杂交炉中68℃杂交16～24 h，用1XSSC、0.1 %SDS洗膜，再用0.1XSSC、0.1 %SDS洗膜后用X光片放射自显影，于-70℃曝光6 h～2 w。显影后用密度扫描仪分析结果。内参照探针选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。 3.统计学分析：实验结果采用方差分析，再行Newman-Keuls检验。 二、结果 1.12例正常皮肤标本和术后皮肤标本的总RNA经变性凝胶电泳后显示清晰的5S、28S和18S条带(图1)。 2.每份标本约10 ug总RNA用于RNA印迹法，为1例患者术前和术后1、3、5 d皮肤组织中KGF cDNA探针杂交后曝光2 w的显影，1泳道为术前组织杂交显影，2泳道为术后1 d皮肤组织杂交显影，3泳道为术后3 d皮肤组织杂交显影，4泳道为术后5 d皮肤组织杂交显影，术后3 d皮肤组织的KGF杂交条带辉度明显强于术前和术后1 d、5 d的皮肤标本(图2)。
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复发性星形细胞瘤P16基因的研究
一、材料与方法研究对象为我院神经外科手术治疗的星形细胞瘤患者.首次手术肉眼全切除肿瘤,二次手术前未行放疗,共得到符合条件患者22例,对照组为外伤内减压脑组织标本8例.采用改良法提取石蜡切片DNA.P16基因参考赵坡等(中华病理学杂志,1997,26:310)设计的P16 exon2引物.内对照引物采用Izomoto (Cancer lett, 1995,97:241-247)等设计的GAPDH基因引物.PCR产物行凝胶电泳,采用图像分析软件计算两条扩增带的光密度比值.
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毛细管电泳用于测定人绒促性素的解离亚基及其质量控制
人绒促性素(hCG)是用于治疗不孕症等的常用药物.其由α亚基和β亚基组成,研究发现hCG在生产及储存过程中均可能产生亚基的解离,从而影响其活性.本文旨在建立hCG解离亚基的测定方法,通过考察样品制备缓冲体系、样品制备温度、分离电压、毛细管温度等,建立了毛细管电泳(CE-SDS)定量测定hCG解离亚基的方法.方法验证结果表明,α亚基和β亚基含量具有良好的灵敏度、线性、准确度和精密度,优于传统的凝胶电泳SDS-PAGE.本文所开发的方法适用于不同来源的hCG,并可应用于指导工艺开发及稳定性研究.因此,该方法应作为hCG生物制品的重要质控方法.
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乳化溶剂挥发法制备重组人血管内皮抑制素缓释微球
目的:制备重组人血管内皮抑制素(恩度)缓释微球,并对微球理化性质及体外释放行为进行初步考察.方法:采用乳化溶剂挥发法(W/O/O)制备恩度载药微球;对微球载药量、粒径、突释、体外释放速率及降解行为进行考察,同时利用凝胶电泳初步评价体外释放过程中恩度的完整性.结果:增加聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)中羟基乙酸的比例、提高PLGA浓度、降低内水相体积、提高理论载药量均增加微球载药能力;降低内水相体积、提高分散速度均减小突释.增加PLGA中羟基乙酸的比例,30 d时累积释放可增加到65%.降解实验说明释放初期微球主要以扩散方式释放恩度,释放后期主要表现为微球的降解.凝胶电泳结果表明微球制备过程对蛋白质聚集性的影响不大.结论:用PLGA作为载体材料制备微球,可以延缓恩度的释放.
关键词： 重组人血管内皮抑制素 聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物 扫描电镜 凝胶电泳 释放
