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基因芯片技术在乙型肝炎病毒基因分型检测中的应用探讨
目的:探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.方法:查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术,通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比,探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.结果:HBV的基因分型,既可通过全基因序列比对,也可通过片段基因序列比对,片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法,现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点,技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道.结论:借鉴现有的PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法,如微板核酸杂交-ELISA显色技术,理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的,并且具有高效、快速和廉价等特点.
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人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是引起尖锐湿疣甚至癌变的病原体.PCR技术检测病毒DNA序列具有特异、敏感等特点,但对仪器设备及检测人员技术要求较高,不适合于基层医疗单位临床实验室的常规诊断方法.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术针对靶基因6个区域设计4条特异引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下完成扩增,扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测,具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点.国内外利用LAMP技术检测HPV的方法研究偶有报道[1-2],但针对HPV-6和HPV-11成功的方法研究未见文献报道.
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致病性大肠埃希菌O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr) ompA 基因的克隆及序列分析
目的 应用PCR扩增大肠埃希菌O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78的外膜蛋白A(ompA)基因,并进行克隆.方法 根据GenBank中人源大肠埃希菌K-12的ompA核苷酸序列设计特异引物,应用PCR对大肠埃希菌O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78的ompA 基因进行体外扩增、克隆和序列分析. 结果 O2、O78和O2,78经PCR获得的ompA基因片段大小为1 041 bp,与理论值相符;经过克隆和测序分析,该基因的核苷酸序列均由2 271 nt组成,编码1个由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A,三菌株ompA基因核苷酸序列与GenBank提供的已知基因序列比较,同源性均为100%. 结论 本研究成功克隆了大肠埃希菌ompA基因全长.
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survivin及其选择性剪接变体在胃癌中的表达及意义
survivin基因有4个外显子和3个隐含外显子(2α、2B和3B),同一个基因的转录产物通过选择性剪接方式产生多种成熟mRNA.目前发现人类存在5种不同剪接变体[1-2].我们分别设计了5种survivin剪接变体特异引物,即时荧光定量检测其在胃癌中的表达,同时分析各种变体之间以及其表达水平与临床病理资料之间的相关性.
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HBV DNA的前C区1896 G/A变异与血清HBV DNA水平
为探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C区1896 G/A变异对血清HBV DNA水平复制及临床表现的影响,本研究报道采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR方法(FQ-PCR)及突变特异引物PCR方法(AS-PCR)对95例诊断符合2000年修订的病毒性肝炎防治方案的HBV感染者进行了HBV血清免疫标志物和HBV DNA定量及HBV DNA 1896位点G/A变异检测的结果.
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人鼠嵌合Fab抗体通用表达载体的构建和抗人肝癌相关抗原HAb18G嵌合Fab抗体的表达
目的:构建一个在大肠杆菌中表达人鼠嵌合Fab抗体的通用载体,并用于抗人肝癌相关抗原HAb18G人鼠嵌合Fab抗体的表达.方法:利用特异引物PCR扩增人IgG3的CHl和Ck基因,分别克隆到表达载体pComb3中,从而构建成人-鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体pComb3C.然后将扩增的mAbHAbl8的VL和VH基因分别组装到通用表达载体中,酶切去除gⅢ片段后,连接成为HAb18嵌合Fab抗体的分泌型表达载体pComb3C/cFab.转化大肠杆菌后诱导其表达,通过ELISA检测产物的表达和定位.后,利用亲合层析纯化表达产物,进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,同时采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的亲和力和特异性.结果:测序及酶切鉴定表明,人IgG3的CHi和Ck基因正确插入到pComb3中,大小分别为324bp和333 bp,同时mAb HAb18的嵌合Fab基因也分别获得正确组装和表达.表达产物的分子质量约为45 ku,主要位于周质腔中.另外,ELISA和免疫荧光检测证实,表达产物含有人的抗体片段,并具有与相应抗原特异结合的活性,亲和力约为亲本抗体的10%.结论:成功构建了人鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体并制备了抗人肝癌小分子嵌合Fab抗体,为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础.
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心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒核酸序列(摘要)
目的分析自心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒的核酸序列,探讨病毒病因的分子基础。方法使用肠道病毒特异引物对从心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒RNA进行RT-PCR扩增,PCR产物经纯化后分别经不同的引物正反向直接核酸循环测序,并应用SeqEd和DNA软件及Assem blyLIGN软件对测序结果进行分析。结果确定7株病毒5'端从核苷酸位点40到750之间710 bp基因序列;序列分析结果发现,尽管为同血清型病毒,但其5'端非编码区基因变异率仍在25%左右,而血清型为柯萨奇B5病毒则高达34.08%,与肠道病毒各血清型之间5'端非编码区基因变异率无明显差异;对血清型为CVB3的两分离株病毒5'端基因特殊位点分析,发现与CVB3标准株(Nancy株)比较234位由T→C、690位由C→A。结论确定了所分离到的一些肠道病毒5'端非编码区基因序列;肠道病毒5'端非编码区基因与血清型关系不大;CVB3分离株5'端基因特殊位点变异与致病的关系值得进一步探讨。[全文刊登于中华微生物学和免疫学杂志2001.21(1):21]
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121用改进的PCR方案测定PCR指纹条带序列后设计的特异引物对新生隐球菌新生变种作基因分型
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皮炎外瓶霉分子鉴定的初步研究
目的:设计皮炎外瓶霉种特异性引物,并对其特异性及敏感性进行检测.方法:通过对暗色真菌核糖体DNA进行分析,设计皮炎外瓶霉种特异性引物;实验菌株包括标准株、参照株及临床分离株等皮炎外瓶霉,以及甄氏外瓶霉、裴氏着色霉、卡氏枝孢霉、疣状瓶霉等,应用常规聚合酶链反应(PCR)及快速PCR方法检测其特异性及敏感性.结果:序列分析显示皮炎外瓶霉rRNA基因转录内间隔区较为保守,特异引物对15株皮炎外瓶霉均可扩增出单一的特异性片断,将模板稀释成1万倍后仍可得到相同的结果,其他致病菌种均为阴性.结论:皮炎外瓶霉种特异性引物具有较高的特异性及敏感性,可试用于该菌种的鉴定.
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弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达
构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒.设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVA C而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况.PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达.成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8.
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内蒙古林区蜱咬人群人粒细胞埃里希体病DNA检测
人粒细胞埃里希体病,是1994年美国发现的嗜人类粒细胞埃里希体(human granulocgtic ehrlichia)引起的人粒细胞埃里希体病,一些硬蜱是其主要传播媒介,其临床表现主要有发热、寒战、不适、肌痛、头痛等类感冒症状和恶心、呕吐、意识模糊等,严重者出现肾功能衰竭和中枢神经系统受损,甚至死亡[1]. 2001年黑龙江省林区的全钩硬蜱中检测出人粒细胞埃里希体病原体DNA,首次证明我国东北林区存在人粒细胞埃里希体病原体及可能存在其感染的自然疫源地[2].内蒙古林区已从蜱咬人群血中检出HGE 的IFA抗体,我们应用多聚酶链反应(polgmerase chain reaction,PCR)技术和人粒细胞埃里希体的16SrRNA基因的特异引物对内蒙古大兴安岭林区的部分人群血标本进行人粒细胞埃里希病体病原体检测.
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大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达
设计大鼠β-防御素rBD-1 cDNA序列一对特异引物:R1 5'→3' ACTCTGGACCCTGACTTTCACCG;R2 5'→3'CCCTTGCTTGTCCTTTATGTCC.
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β-防御素-2基因在子宫颈的固有表达
根据Gene Bank大鼠β-防御素-2 cDNA序列,设计特异引物:R15'3'GCA CCA GGC TTC AGT CAT G;R25'3'CAT GGA GGA GCA AAT TCT G.引物由Gibco公司合成.取Wistar大鼠宫颈组织,用Qiagen公司生产的RNA提取试剂盒提取总RNA,以此为模板,采用RT-PCR技术,按照试剂盒说明操作,扩增cDNA,反应条件下:50℃保温30 min,使mRNA逆转录为cDNA;94℃预变性2 min,然后进行30个PCR循环:94℃ 30 s,58℃退火30 s,68℃延伸45 s;后在68℃继续延伸7 min.RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,其结查显示应用上述β-防御素-2引物,从大鼠宫颈总RNA中扩增出了一条约290 bp的DNA片段,该片段大小与预测的大鼠β-防御素-2 cDNA片段大小一致.人β-防御素-2于1997年从人银屑病皮损组织中分离获得,具广谱抗菌活性.新近从Gene Bank中检索到与人β-防御素-2同源的大鼠cDNA序列,但尚未见文章发表.日本和美国学者报道子宫颈粘液具抗菌活性,并认为这种抗菌活性是由于溶菌酶的作用.我们和国外另一些学者的研究显示宫颈粘液溶菌酶含量低,难以解释宫颈粘液强大而广谱的抗菌活性.本实验研究提示β-防御素-2可能是子宫颈抗感染作用的重要介质.
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引物标记技术在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用
目的 在GeXP系统中应用CY5标记的特异引物代替通用引物,建立一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R-SA)的方法.方法 设计mecA与nuc基因引物,经聚合酶链反应(PCR)扩增琼脂糖电泳验证引物特异性并优化PCR反应条件.用荧光染料CY5标记单条引物(单独标记上游或下游引物).以提取的MRSA、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)核酸为模板液,采用已标记引物进行单重及多重PCR,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳分析,验证应用效果.再通过采用混合标记引物的GeXP系统检测100株M RSA,分析其应用效果.结果 单标记下游引物的GeXP-PCR的杂质扩增峰较少.经GeXP系统检测分析的MRSA、MRCNS、MSSA均出现目的特征峰,能明确辨别其含有大小不同的基因片段,结果与琼脂糖电泳一致;经GeXP系统分析的100株MRSA均含有nuc与mecA片段,与VITEKⅡCompact检测结果相符.结论 单独标记下游引物应用于GeXP检测M RSA的方法可行.
关键词: 标记 特异引物 GeXP系统 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 -
血管内皮细胞在切应力刺激后Toll基因的表达变化
目的:本室先前的实验观察到原代培养的贴壁融合脐静脉内皮细胞层流刺激后,IL-8 mRNA的增强表达和NF-κB的活化.本文探讨Toll蛋白在切应力诱导血管内皮细胞表达趋化细胞IL-8基因表达中的可能作用.方法:从正常对照和层流刺激后的原代培养的人脐静脉内皮细胞提取总RNA,根据TLR-2和TLR-4cDNA序列设计特异引物,应用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,并经DNA序列测定于以证实.RT-PCR产物经凝胶电泳后,在凝胶成像分析仪上进行电泳条带的灰度半定量分析.
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大鼠不同发育阶段β-防御素-2基因在肺组织的表达研究
目的:探讨大鼠β-防御素-2基因在肺组织表达的发育调控.方法:根据Genbank大鼠β-防御素-2的cDNA序列,设计一对特异引物.采用RT-PCR技术在大鼠不同发育阶段的肺组织总RNA中,扩增其特异cDNA片段,并进行DNA序列测定.借助Genbank中BLAST程序,将从该cDNA序列推导的氨基酸序列与人的hBD-2和大鼠的rBD-1做相似性分析.结果:从足月胎鼠、出生8h和4日以及成年大鼠相同重量肺组织所提取的总RNA中,均扩增出一条密度相同、长度约为220bp的cDNA片段.
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β-防御素-1基因在大鼠皮肤和肾脏固有表达
目的:检测大鼠β-防御素-1基因表达的组织分布.方法:从Genbank检索到的Norway大鼠β-防御素-1 cDNA序列,据此设计一对特异引物,采用RT-PCR技术在Wistar大鼠10种受检测组织的总RNA中,扩增其特异cDNA片段,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定.结果:在10种大鼠组织中,仅从皮肤和肾脏扩增出一条长度为272bp的cDNA片段,在气管、子宫、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、腮腺等均未检测出其mRNA.其RT-PCR产物经测序分析证明系大鼠β-防御素-1 cDNA.结论:本研究显示大鼠β-防御素-1基因除在肾脏表达外,亦在皮肤组织固有表达,提示β-防御素-1亦可能在大鼠皮肤天然抵抗微生物感染机制中发挥作用.
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食管癌组织中HPV16型L2线性抗原基因的克隆及原核表达
[张菊,阎小君,严泉剑,段杰,侯瑜,苏成芝.世界华人消化杂志,2001;9(3):273-278]目的通过聚合酶链方法,以特异引物,从感染人乳头瘤病毒的新鲜食管癌组织获得人乳头瘤病毒1 6型晚期表达基因I2保守区线性抗原片段的基因,并体外表达,获得具有抗原活性的原核表达蛋白,以探索研制低廉,方便及准确的人乳头瘤病毒感染的新型诊断试剂.方法在前人研究的基础上,经计算机检索,选定与食管癌高度相关的人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2N端的一段基因,采用特异引物及聚合酶链方法从多例人乳头瘤病毒感染的食管癌组织DNA模板中,获得人乳头瘤病毒16型晚期表达基因L2保守区线性抗原片段的基因,经克隆入测序载体验证DNA大小及序列后,将HPV16 L2 DNA保守区线性抗原基因片段克隆入高效原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,初步以Western-blot测定表达产物的抗原性:与乳头瘤病毒抗体及感染者血清的反应活性.结果以我们设计的特异引物,从两例人乳头瘤病毒感染阳性的食管癌组织DNA模板中以得到预期大小的PCR产物,并能插入预定的克隆载体中测序,所得基因的序列符合目的基因的序列,且两例组织所得的目的DNA序列完全一致,其插入大肠杆菌表达载体能获得表达,且表达产物具有抗原活性,能与商品化的乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应.结论从食管癌组织中能检出人乳头瘤病毒HPV16型晚期表达基因区L2特定片段的基因,该片段确具高度保守性.在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物,有抗原活性,有望用于流行病学检查,预警人乳头瘤病毒感染相关的癌症发生. (潘伯荣)
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LAMP技术及其在水生动物疫病诊断中的应用
环媒恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新颖的核酸扩增方法,其基本原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在65℃左右对核酸进行扩增,短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝.LAMP具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点,目前已应用于人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测,预计在动植物疫病检疫,尤其是水生动物疫病诊断领域有广阔的应用前景.