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人鼠嵌合Fab抗体通用表达载体的构建和抗人肝癌相关抗原HAb18G嵌合Fab抗体的表达
目的:构建一个在大肠杆菌中表达人鼠嵌合Fab抗体的通用载体,并用于抗人肝癌相关抗原HAb18G人鼠嵌合Fab抗体的表达.方法:利用特异引物PCR扩增人IgG3的CHl和Ck基因,分别克隆到表达载体pComb3中,从而构建成人-鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体pComb3C.然后将扩增的mAbHAbl8的VL和VH基因分别组装到通用表达载体中,酶切去除gⅢ片段后,连接成为HAb18嵌合Fab抗体的分泌型表达载体pComb3C/cFab.转化大肠杆菌后诱导其表达,通过ELISA检测产物的表达和定位.后,利用亲合层析纯化表达产物,进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,同时采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的亲和力和特异性.结果:测序及酶切鉴定表明,人IgG3的CHi和Ck基因正确插入到pComb3中,大小分别为324bp和333 bp,同时mAb HAb18的嵌合Fab基因也分别获得正确组装和表达.表达产物的分子质量约为45 ku,主要位于周质腔中.另外,ELISA和免疫荧光检测证实,表达产物含有人的抗体片段,并具有与相应抗原特异结合的活性,亲和力约为亲本抗体的10%.结论:成功构建了人鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体并制备了抗人肝癌小分子嵌合Fab抗体,为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础.
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亲合层析微柱法测定糖化血红蛋白在糖尿病诊断中的作用
随着年龄的增长,机体的糖耐量逐渐下降,糖尿病的发病率逐渐上升.故糖尿病主要危害中老年人群.本文以中老年人群为对象,探讨了糖化血红蛋白(HbA1c)在糖尿病诊断中的作用.
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共价连接β2m的HLA-A2/IgG1二聚体的构建、表达与纯化
目的 HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白.方法 利用基因重组技术构建β2m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3-1(+)-[β2m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率.结果 β2m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.22I细胞后可表达正确构象的β2m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍.结论 共价连接β2m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整.
关键词： β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白 真核表达 亲合层析 构象完整 -
富组蛋白-5表达质粒构建及抗菌功能研究
目的 构建富组蛋白-5(histidine-rich protein-5,HRP-5)重组表达载体,表达并纯化HRP-5蛋白,观察其抗菌作用.方法 用基因克隆的方法构建pET-32a-HRP-5重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化HRP-5融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,琼脂糖弥散法检测其抗菌功能.结果 成功构建了pET-32a-HRP-5表达质粒并表达、纯化出HRP-5融合蛋白,融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌PAO1有抗菌活性.结论 HRP-5是一种抗菌分子,参与了机体的天然免疫防御功能.
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中华绒螯蟹重组金属硫蛋白的原核表达与分离纯化
金属硫蛋白(MT)由于其独特的结构和性质,而成为潜在的医用蛋白资源.本研究将重组中华绒螯蟹金属硫蛋白基因cDNA克隆入原核表达载体pET-GST,转化大肠杆菌BL21.重组蛋白以可溶和包涵体两种形式表达.根据金属硫蛋白的特性,优化了表达条件.Western blot证实了表达产物的正确性,用锌柱亲合层析得到高纯度的重组金属硫蛋白.为以后金属硫蛋白的生物学功能研究奠定了良好的基础.
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家兔MT-Ⅰ基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离
采用RT-PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白-Ⅰ(Metallothionein-Ⅰ,MT-Ⅰ)基因的cDNA全长,克隆入原核融合表达载体pQE40,转化大肠杆菌M15.菌落印迹法检测阳性菌株;Western blotting 分析重组融合蛋白的表达方式;经SDS-PAGE电泳后,ImageMaster VDS software 分析融合蛋白诱导表达条件;并采用Ni-NTA agarose纯化融合蛋白.结果发现,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶(包涵体)两种形式,表达量随IPTG诱导时间延长而增加,9 h达高峰(占菌体不溶性蛋白总量的57.4%),经Ni-NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白,为进一步分离目的蛋白单体并研制和开发这一产品提供了可靠依据.
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人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测
为了获取神经营养素-3(NT-3)将之用于神经系统疾病的治疗,采用RT-PCR技术,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人NT-3全长以及成熟蛋白编码基因,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pET28a,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-NT3和重组原核表达载体pET28-NT3s.pcDNA3.1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养5 d,MAP-2(微管相关蛋白2)免疫细胞化学反应结果显示,转染细胞株所表达的NT-3蛋白具有生物学活性,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长.将pET28-NT3s转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约18 kD的6XHis-NT3融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的20%左右.经镍柱亲和纯化,得到纯度达95%的rhNT-3蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性.
