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GeXP多重基因表达遗传分析系统对2009～2012年济南市手足口病病原谱的研究
本研究旨在利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,检测与手足口病密切相关的多种肠道病毒类型,探明济南市手足口病病原谱的构成.选取济南市2009～2012年6月手足口病病例标本274例,经多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,研究与手足口病密切相关的15种肠道病毒:肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A,CVA) 16、4、5、6、9、10型和柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)1、3、5型,以及埃可病毒(Echovirus,Echo)6、7、11、13、19.结果显示:2009～2012年济南市手足口病274例标本中,检出EV71 69例(25.18％),CVA16 44例(16.06％),CVA10 39例(14.23％),CVA6 20例(7.30％),CVB1 3例(1.09％),Echo6 2例(0.73％),CVA9 1例(0.36％),CVB3 1例(0.36％);两种以上病原体混合感染14例(5.11％).CVA10和CVA6是引起济南市手足口病的两大病原体,仅次于EV71和CVA 16;流行季节为4～8月,发病高峰分别在4月和6月.利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,首次明确了济南市手足口病的肠道病毒主要类型,为济南市手足口病疫情的防控及临床治疗提供了科学依据.
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GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用
利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒一人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型.优化多重反应体系中针对5'UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度.结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA.该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查.
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GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒
本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒.针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性.多重检测体系在103拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒.另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系.结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒.
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8种脑炎相关虫媒病毒GeXP检测方法的初步建立
利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应( mRT-PCR)方法,同时检测与病毒性脑炎相关的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)等8种虫媒病毒.优化多重反应体系及反应条件,分别以病毒分离培养物和阳性标本来验证多重反应体系的特异性,以克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度.结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出各病毒对应的特异片段,并可在102拷贝/μL水平同时并特异地检测出8种(共13个特异片段)脑炎相关病毒RNA.该方法具有高通量、灵敏度高、特异性强且快速等优点,对病毒性脑炎的分子诊断及流行病学调查具有重要意义.
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应用GeXP系统检测败血症患者肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因的研究
目的 采用GeXP系统检测肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因,以指导败血症患者的临床治疗. 方法 从败血症患者血液标本中分离出肺炎克雷伯杆菌,用建立GeXP多重耐药基因检测体系,对其多重耐药基因进行检测. 结果 扩增出的7对特异性目的基因片段的大小与设计的引物相符合,拼接后比对与基因库中公布的相应基因序列吻合.以该引物多重PCR扩增肺炎克雷伯多重耐药基因,扩增产物用GeXP毛细管电泳分离,根据扩增的基因片段大小确定各峰分别为rmtB (176.71/179.03 bp)、aac(6')-Ib(190.74/192.56 bp)、aac(6')-Ⅱ(218.67 bp)、armA (249.84 bp)、aac(3)-Ⅱ(268.63/270.51 bp)、aph(3')-Ⅳ(289.18 bp)、ant(3')-Ⅰ (319.24/320.99 bp),片段长度与理论值误差为3～5 bp,即在GeXP毛细管电泳分离过程中发生了片段大小漂移现象. 结论 采用GeXP系统能从败血症患者感染的肺炎克雷伯杆菌检测出7个不同大小的耐药基因,可据此指导败血症的临床治疗.
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多重基因分析系统检测幽门螺杆菌的初步研究
目的：评估一种全新的幽门螺杆菌（HP）检测方法，即利用多重基因分析系统（GeXP系统）检测HP感染。方法分别用培养法、快速尿素酶法、普通聚合酶链反应（PCR）和多重基因检测法检测胃活检组织标本中的HP，用Stata 12．0统计软件评估各种方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值，从检测方法角度横向评估多重基因法检测HP的有效性；选取16S rRNA、ureA、ureC、26KDa、cagA基因作为HP的诊断基因并做多重基因检测，从多重基因检测角度纵向评估GeXP系统检测HP感染的有效性。结果培养法的敏感性为76．8％，特异性为100．0％，阳性预测值为100．0％，阴性预测值为57．7％；快速尿素酶法的敏感性为87．8％，特异性为80．8％，阳性预测值为93．5％，阴性预测值为67．7％；普通PCR的敏感性和特异性高，均为100．0％。GeXP系统敏感性和特异性分别为100．0％和71．3％，阳性预测值为90．9％，阴性预测值为100．0％。结论初步建立的诊断HP感染的多重基因检测法（GeXP系统）具有高敏感性、高特异性以及高通量的特点，不仅可以满足临床标本检测的需求，还可以进行根除治疗后的预后监测，具有很高的临床应用价值。
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GeXP多重分析技术检测肝癌组织长链非编码RNA表达的实验研究
目的 运用多重基因表达遗传分析系统(genomelab gene expression profiler,GeXP),创建一种能同时检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织长链非编码RNA(long non-codingRNA,LncRNA)表达的一种多重逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法,为HCC的诊断及预后提供一定的方法学基础.方法 检索并筛选Pubmed数据库中近10年发表的与HCC有关报道的8种LncRNAs,并分别设计特异性引物.首先验证引物及多重反应体系的特异性及灵敏性,经过系统优化后建立一种多重RT-PCR检测方法.另检测23对HCC肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织标本,并用实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qPCR)来验证检测体系并进行结果统计. 结果 优化后的GeXP多重检测体系,特异性及灵敏性良好.另在23对HCC肿瘤组织及癌旁组织中检测到了这8种LncRNAs的差异表达:与癌旁组织相比,HCC组织中LncRNA NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1、BCAR4的表达显著下降(P均＜0.05);肝癌组织中LncRNA GAS5的表达显著上升(P＜0.05).qPCR方法验证与GeXP方法结果一致.结论 应用GeXP多重分析技术成功建立了一种于单管中同时检测HCC组织8种LncRNAs表达的检测方法,该方法有效、快捷、灵敏、特异,对HCC的诊断及预后具有启示作用并奠定了一定的方法学基础.
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引物标记技术在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用
目的 在GeXP系统中应用CY5标记的特异引物代替通用引物,建立一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R-SA)的方法.方法 设计mecA与nuc基因引物,经聚合酶链反应(PCR)扩增琼脂糖电泳验证引物特异性并优化PCR反应条件.用荧光染料CY5标记单条引物(单独标记上游或下游引物).以提取的MRSA、甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)核酸为模板液,采用已标记引物进行单重及多重PCR,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳分析,验证应用效果.再通过采用混合标记引物的GeXP系统检测100株M RSA,分析其应用效果.结果 单标记下游引物的GeXP-PCR的杂质扩增峰较少.经GeXP系统检测分析的MRSA、MRCNS、MSSA均出现目的特征峰,能明确辨别其含有大小不同的基因片段,结果与琼脂糖电泳一致;经GeXP系统分析的100株MRSA均含有nuc与mecA片段,与VITEKⅡCompact检测结果相符.结论 单独标记下游引物应用于GeXP检测M RSA的方法可行.
关键词： 标记 特异引物 GeXP系统 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 -
GeXP多重RT-PCR技术在呼吸道病毒检测中的应用
目的 应用GeXP多重基因表达遗传分析系统多重RT-PCR技术检测急性呼吸道感染儿童呼吸道样本中的呼吸道病毒并探讨其在儿童呼吸道感染病毒检测中的价值.方法 回顾性检测2010年7月～2012年6月期间因疑似急性呼吸道感染就诊的1 800名儿科患者的呼吸道样本,应用GeXP多重基因表达遗传分析系统多重RT-PCR技术对呼吸道合胞病毒、鼻病毒等多种呼吸道病毒进行检测.采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析.结果 GeXP多重RT-PCR方法检测到样本中的10种呼吸道病毒.样本中共有67.33％(1 212/1 800)的样本至少有一种病毒检测结果为阳性.这1212份病毒阳性标本中,人类鼻病毒(HRV)阳性多,为375份,阳性率20.83％;其次为呼吸道合胞病毒(RSV) 249份,阳性率13.83％;其他依次为人类腺病毒(HADV)、人类副流感病毒3(HPIV-3)、人类博卡病毒(HBoV)、甲型流感(InfA)、人类副流感病毒4(HPIV-4)、流感C(InfC)、人类偏肺病毒(hMPV)和乙型流感病毒(Inf B);阳性率分别为8.89％,6.5％,5.3％,5.3％,3.3％,1.5％,1.11％和0.67％.不同性别间患儿呼吸道病毒阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).研究中观察到13.5％(243/1 800)的病例同时感染两种或两种以上的病毒,其中两种病毒的混合感染为210例(11.67％),3种病毒混合感染为33例(1.83％).呼吸道病毒的感染率存在季节差异,RSV大多在春季和冬季流行,HBoV,hMPV,InfA,InfB和HPIV-3大多是在春季流行,而HADV和HPIV-4主要在夏季流行,Inf C大多是在秋季流行.结论 GeXP分析系统多重RT-PCR方法是一个快速、高通量、高灵敏度且特异度强的检测分析方法,可用于急性呼吸道感染临床分子诊断和流行病学研究.
