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环介导等温扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌的研究
[目的]寻找1种快速的,且敏感度高,特异性强的结核分枝杆菌的检测方法.[方法]环介导等温扩增基因检测(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)是一种便捷、灵敏度高而又特异性强的核酸基因扩增检测技术.本课题组根据结核分枝杆菌gyrB特征性序列设计3对特征性引物对痰液中和培养基中的结核分枝杆菌进行检测.其中1对环状引物结合于特征性序列中环状结构部分,可极大地加快LAMP反应速度,且不干扰内引物在LAMP反应中作用.[结果]实验结果表明:使用环状引物的LAMP反应可在0.5h内完成,总共分析时间不超过1h.LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,LAMP检测技术具有与实时PCR(Real-time PCR)技术相同的特异度.另外,由于LAMP检测技术是在恒温的情况下进行,不需要特别昂贵的仪器设备,检测方法简单,结果判定直接.[结论]该方法的特点和优势可以使之在基层实验室及现场监测方面广泛使用,在快速检测方面具有一定的开发潜力.
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蓝谱环介导等温扩增试剂盒(通用型)
环介导等温扩增(LAMP?)方法采用4条引物来识别目的基因上的6个特异区域,利用具有链置换特性的DNA聚合酶,在恒温(60~65?C)条件下进行扩增,15~60m i n内的扩增效率可达109~1010倍,对仪器设备要求低,水浴锅或恒温箱即可,反应结果可通过肉眼直接观察。DNA样本或RNA样本均可直接使用试剂盒进行反应。
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人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是引起尖锐湿疣甚至癌变的病原体.PCR技术检测病毒DNA序列具有特异、敏感等特点,但对仪器设备及检测人员技术要求较高,不适合于基层医疗单位临床实验室的常规诊断方法.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术针对靶基因6个区域设计4条特异引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下完成扩增,扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测,具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点.国内外利用LAMP技术检测HPV的方法研究偶有报道[1-2],但针对HPV-6和HPV-11成功的方法研究未见文献报道.
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环介导等温扩增技术的应用和发展
扩增是生命科学领域的常用研究工具,20世纪80年代出现的聚合酶链反应(PCR)得到了广泛的应用,但该方法需要特殊的仪器、模板的热变性及长时间的温度循环.20世纪90年代出现了几种核酸等温扩增方法:核酸等温扩增法、自序列复制法和链置换扩增法等,它们或者需要精密的仪器,或者在产物检测方面相当繁琐,或者特异性不高等[1-2],均限制了其广泛应用.
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LAMP技术及其在水生动物疫病诊断中的应用
环媒恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新颖的核酸扩增方法,其基本原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在65℃左右对核酸进行扩增,短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝.LAMP具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点,目前已应用于人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测,预计在动植物疫病检疫,尤其是水生动物疫病诊断领域有广阔的应用前景.