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聚合酶链反应直接测序法检测细胞色素b5还原酶基因突变
在DNA突变检测方法中,DNA测序能精确判断突变部位和性质,是具决定性的一步.聚合酶链反应(PCR)产物经直接测序分析而不预先克隆到测序载体上,使序列分析的效率极大提高.我们从遗传性高铁血红蛋白血症患者外周血白细胞提取总RNA,经逆转录(RT)合成cDNA,用半巢式PCR方法扩增其NADH-细胞色素b5还原酶编码基因,并进行了PCR产物直接序列分析,取得满意的结果.证明逆转录PCR产物直接测序法是检测基因错义突变的迅速有效的方法.
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SARS患者肝脾心肺组织中病毒的分离和鉴定
目的:从SARS患者尸检肝、脾、心、肺组织中分离病毒并鉴定及评定中和抗体与SARS病程的关系.方法:取各组织100 g/L匀浆后的上清,接种非洲绿猴肾单层细胞,观察细胞病变;采用RT-PCR及序列分析等技术鉴定病毒并研究其生物学特性;将收集的SARS患者早期和恢复期血清做中和实验.结果:分别从SARS患者尸检肝、脾、心、肺等组织中分离到致细胞病变的病毒,用各组织的病变细胞提取的RNA为模板分别扩增出部分S区和N区的DNA片段,经DNA序列分析表明所有S区和N区的核苷酸序列均与GenBank上的SARS冠状病毒该区域的序列完全一致,中和实验显示所做10份SARS患者双份血清均有中和抗体效价的4倍升高,轻症患者中和抗体产生时间明显早于重症患者.结论:从SARS患者尸检肝、脾、心、肺组织中分离到的均为SARS冠状病毒,证实SARS冠状病毒可直接侵害患者的肝、脾、心、肺脏器.所有SARS患者均可产生中和抗体,中和抗体产生时间与疾病进程有一定关系.
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乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1的克隆化与序列分析
目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定.然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果:PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误.转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PCR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828.结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP2的克隆
目的:筛选与克隆HCV核心蛋白反式激活新型靶基因.方法:以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:新基因命名为TAHCCP2,编码序列全长为429个核苷酸(nt),编码产物由142个氨基酸残基(aa)组成,测序证实TAHCCP2克隆正确.在GenBank中注册,注册号为AY039043.结论:筛选与克隆HCV核心蛋白反式激活新型靶基因TAHCCP2,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆
目的:为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制,筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因.方法:以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,确定新型基因序列并命名为XTP5.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列.结果:XTP5基因的编码基因序列全长为1527个核苷酸(nt),编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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小鼠肝脏干细胞提取法的优化
肝脏干细胞(liver stem cell,LSC)源于前肠内胚层,近年研究表明,除肝脏外,骨髓、胰腺等组织中也存在LSC.LSC主要包括胚胎时期的干细胞样肝原始细胞(liver original cell)和成体时期的肝卵圆细胞(hepatic oval cell,HOC).HOC是成年哺乳动物肝脏中一类直径约10 μm的卵圆形细胞,存在于终末小胆管(Hering),1956年由Farber[1]在大鼠肝癌模型中首先发现并命名,具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向潜能[2,3]并与肝脏损伤后的强大再生修复能力密切相关.
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尿激酶静脉内溶栓治疗急性心肌梗塞的临床观察
尿激酶系肾脏制造的一种活性蛋白质,近年来由人工培养人肾胚细胞提取,系外源性纤维蛋白溶解系统的激活剂,能直接使纤维蛋白溶解酶原转化为纤维蛋白溶酶,而达到溶解新鲜血栓中的纤维蛋白并消耗凝血因子使血栓溶解。在诸多溶栓药物中,其价格相对便宜,是目前国内首选的溶栓剂,半衰期短(16~22分),无抗原性,不引起过敏反应。我院对47例急性心肌梗塞患者行尿激酶100万U~150万U静脉溶栓治疗取得较好疗效,再通率达61.70%,其中前间壁、广泛前壁再通率(71%~73%)明显高于下壁和正后壁及心内膜下A M I(42.8%~50%),其溶栓效果与发病时间呈反相关系,即溶栓距发病时间越短交果越好。急性心肌梗塞静脉溶栓再通可以挽救濒死心肌,缩小梗塞面积,改善左室功能,减少心律和室壁瘤的形成,提高运动耐力,减少梗塞后心绞痛的发生。故急性心肌梗塞静脉溶栓治疗简便易行,值得临床推广应用。
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神经干细胞提取及培养方法的体会
神经干细胞提取及体外培养的方法有多种,但采用不同方法所得到的神经干细胞的活力与稳定性均不同.通过对提取和体外培养SD胎鼠大脑皮质神经干细胞的过程进行思考,总结出神经干细胞的提取步骤、提取要点、培养基的选择依据、接种密度的选择、培养方法、换液方法、传代时机、传代方法,终获得大量活力和稳定性均较高的神经干细胞,并将其应用于相关方面的基础研究.
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神经干细胞向运动神经元分化及移植的研究进展
神经干细胞是神经科学领域研究的热点之一.在体外适当的条件下神经干细胞可诱导分化成运动神经元,如添加生长因子、相关信号分子、或添加从脊髓源性神经胶质细胞提取的特殊培养液和骨骼肌培养液等,定向诱导分化的神经元移植于脑或脊髓的病变部位将成为运动神经元退行性病变的潜在治疗方法.
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小鼠几种细胞提取操作的心得
近年来随着流式细胞仪技术在医学科研领域的广泛应用,对单个细胞的提纯技术提出了更高的要求.笔者在实验过程中,先后尝试用不同方法提取小鼠脾细胞、骨髓细胞、成骨细胞、脑细胞用于流式细胞仪检测,取得了较好的实验效果.现把提取上述细胞的心得和方法与大家分享.
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神经干细胞提取与培养方法的比较研究
目的 探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)提取、培养的佳方法,为NSCs的基础研究提供技术参考.方法对NSCs的不同提取、培养方法进行比较:提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法,观察NSCs的成球率和NSCs未分化状态的稳定性.用多功能微孔板读数仪检测NSCs活性.结果 ① 胎龄14 d胎鼠较新生24 h内乳鼠的大脑皮质提取NSCs的比例高,杂细胞少,形成的神经球数量多.② 采用无血清培养基,NSCs可以稳定在未分化状态;而采用含血清培养基,NSCs多数分化为神经元和胶质细胞.③ 以1.0×109·L-1密度接种的NSCs,培养形成的神经球数量多,且状态良好.④ 悬浮培养法较贴壁培养法,可以形成稳定的神经球,有利于保持NSCs处于未分化的状态.⑤半量换液法和只加液不弃液法培养形成的神经球的状态优于全量换液法.⑥ 原代和1代的神经球用机械吹打法传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好,且较其他两种方法简便;2代及以后的神经球用Accutase酶传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好.⑦14 d胎鼠Accutase酶消化组的NSCs活性高于另外3组,差异均具有显著性(P<0.05).结论 提取胎龄14 d胎鼠的大脑皮质,采用无血清培养基,以1.0×109·L-1的密度接种于25 cm2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1 ~1.5 mL,每6~7 d传代1次,所得到的NSCs增殖分裂旺盛,成球率高,神经球状态良好,可以保持稳定的未分化状态.
关键词: 神经干细胞 细胞提取 悬浮培养法:无血清培养基 细胞活性 巢蛋白 -
血液生命平衡治疗前的健康教育
血液生命平衡治疗简称血液净化治疗,它是在量子血、血磁、血稀、激光血疗的基础上发展而来的治本新法,不仅可以消炎抗感染,还可直接从血中将多余的脂类、胆固醇、纤维蛋白原、低密度脂蛋白及衰老死亡的红细胞提取出来,防止这些物质在血液内堆积,去除引起动脉粥样硬化发生的诸多因素,杜绝动脉硬化的发生和发展,可有效地预防和治疗高血脂、高血粘度、高血压及相关性疾病.
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混合热休克蛋白/肽复合物疫苗疫防治小鼠肉瘤
我们从肿瘤细胞提取的不同类型的HSPs/肽复合物对小鼠S180肉瘤模型进行了免疫防治研究,现将结果报道如下.
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简易胶原酶消化法提取兔原代肝细胞及培养
目的 探讨简易、经济的Ⅳ型胶原酶消化法提取分离新生兔原代肝细胞及体外培养.方法 采用0.1%Ⅳ型胶原酶对新生兔肝脏组织小块进行消化以提取兔原代肝细胞,体外进行单层培养,并对提取的兔肝细胞的细胞数量、细胞活力和细胞增殖能力进行检测.结果 提取的肝细胞主要呈类圆形,排列整齐,细胞透亮有光泽,立体感好,细胞界限清晰.1 g肝组织可分离1.12×106个肝细胞,成活率为77%.细胞增殖能力呈先升后降趋势,细胞生长曲线较符合原代细胞生长的一般规律.结论 该实验方法简单、易操作,无需特殊设备,适合一般实验室开展原代肝细胞的提取、分离与培养.
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血管内皮细胞在切应力刺激后Toll基因的表达变化
目的:本室先前的实验观察到原代培养的贴壁融合脐静脉内皮细胞层流刺激后,IL-8 mRNA的增强表达和NF-κB的活化.本文探讨Toll蛋白在切应力诱导血管内皮细胞表达趋化细胞IL-8基因表达中的可能作用.方法:从正常对照和层流刺激后的原代培养的人脐静脉内皮细胞提取总RNA,根据TLR-2和TLR-4cDNA序列设计特异引物,应用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,并经DNA序列测定于以证实.RT-PCR产物经凝胶电泳后,在凝胶成像分析仪上进行电泳条带的灰度半定量分析.
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026.SCD红细胞提取法的数学模型和计算机模拟
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亚甲基四氢叶酸还原酶基因型,年龄,VitB12和叶酸对儿童血浆高半胱氨酸浓度的影响
有关亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)与血浆高半胱氨酸浓度的关系,在成年人中多有研究, 而在儿童中研究甚少.本研究旨在测量健康儿童血浆总高半胱氨酸,叶酸和VitB12的浓度,并确定上述指标与MTHFR之间的关系.对象与方法:选择健康儿童127名为研究对象,其中男58名,女69名,年龄24月~18.75岁 ,均为法裔加拿大人,本人及其父母均无代谢紊乱史,未服用影响血脂或蛋白代谢的药物, 参与研究前少3天无急性疾病.研究时,抽取过夜空腹血样,并将血样收集到含有EDTA的试管中.血浆、红细胞和暗红色分层立即贮藏于-80℃的温度下,以进一步做生化和分子分析.血浆总高半胱氨酸浓度用HPLC测定.叶酸和VitB12用双标记放射免疫分析法测定 .用从白细胞提取的基因组DNA中聚合酶链反应的扩大来分析基因型.结果:血浆中高半胱氨酸的浓度与叶酸和VitB12呈负相关,与年龄呈正相关(P<0.0 001).叶酸和VitB12各占高半胱氨酸变化的27%和19%,而年龄占4 8% .在>10岁的个体中,纯合子突变等位基因(T/T)者的叶酸浓度明显低于纯合子野生型等位基因(C/C)者;T/T者高半胱氨酸的浓度高于C/C和C/T者.结论:在健康儿童中,MTHFR基因型对确定10岁以上儿童高半胱氨酸的浓度起很重要的作用 .(宋桂花王星亮摘张明校)
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慢性粒细胞白血病治疗的新途径--基因免疫诱导CTL杀伤
20世纪90年代初,在传染病及肿瘤治疗史上诞生了一种新的治疗方法--基因免疫(gene immuization),其基本原理是将编码抗原的基因重组质粒直接注射到体内,被体细胞提取并表达出相应的抗原,诱导机体产生特异的CD+8细胞毒性T细胞(CTL)反应,导致分泌该抗原的靶细胞溶解,从而使机体获得保护性免疫而达到彻底治愈肿瘤的目的.基因疫苗是近年来受到人们关注的一种新型疫苗,其刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种,但基因疫苗克服了减毒活疫苗可能反祖并导致人类疾病及病毒发生变异而对新型变异株不起免疫保护作用的缺点,这项新的免疫技术有望成为治疗CML的突破口.