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小鼠黑色素瘤某些生物学特性与其侵袭潜能的相关性研究
目的研究具有相同起源而转移能力不同的小鼠黑色素瘤细胞系(B16、B16F10、B16BL6)的某些生物学特性与其侵袭潜能的相关性.方法用重组基质膜实验考察细胞的侵袭能力;用分光光度法测定黑色素瘤细胞的黑色素含量;利用细胞运动记录分析系统研究细胞在三维胶原基质中的运动状态;用明胶底物酶谱法分析细胞分泌Ⅳ型胶原酶的能力;用端粒重复扩增(TRAP)-PCR 法测定细胞的端粒酶活性.结果 B16BI6和B16F10具有较高的侵袭能力,其运动能力及分泌Ⅳ型胶原酶的能力亦较强,但B16F10的黑色素含量却较低,端粒酶活性在三者之间无明显差异.结论 在所研究的小鼠黑色素瘤不同亚系的某些生物学特性中,侵袭能力与细胞运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶的能力之间有较好的相关性,而与黑色素含量及端粒酶活性无直接相关性.
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抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对人巨细胞肺癌PG细胞侵袭的抑制作用
目的探讨内质网滞留型胞内抗体对Ⅳ型胶原酶分泌及其对人巨细胞肺癌PG细胞侵袭的抑制作用.方法构建了编码胞浆和内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶抗体的表达载体pcDNA3.1-CP.scFv和pcDNA3.1-ER.scFv.对人巨细胞肺癌PG细胞系进行基因转染.以Western blot检测pcDNA3.1-CP.scFv和pcDNA3.1-ER.scFv的表达,明胶酶谱检测PG细胞Ⅳ型胶原酶分泌情况,Matrigel实验检测细胞侵袭.结果 CP.scFv和ER.scFv胞内抗体在PG细胞内表达,ER.scFv对Ⅳ型胶原酶分泌具有显著的抑制作用,对基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的抑制率分别为85.7%和51.2%;而CP.scFv对Ⅳ型胶原酶分泌无抑制作用.ER.scFv编码基因转染的PG细胞与野生型和空白质粒组比较,对体外侵袭有明显的抑制,抑制率为76.3%;而CP.scFv编码基因转染的PG细胞未显示出有抑制作用.结论内质网滞留型胞内抗体技术可以在蛋白加工、分泌通路中抑制Ⅳ型胶原酶的活性,进而抑制肿瘤侵袭,可能在肿瘤基因治疗中具有重要的应用前景.
关键词： Ⅳ型胶原酶 人巨细胞肺癌PG细胞侵袭 -
力达霉素-单抗Fab'片段不同连接偶联物的抗肿瘤作用比较
研究力达霉素与抗Ⅳ型胶原酶单抗的不同连接键的小型化免疫偶联物的抗肿瘤作用.制备长短链的二硫键以及硫醚键抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的Fab'片段连接的免疫偶联物,ELISA法测定偶联物的免疫活性,体外细胞克隆形成测定和体内荷瘤裸小鼠模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用.体外研究显示,Fab'-LDM偶联物部分保留了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11对抗原的亲和力,硫醚键偶联物对体外培养的人纤维肉瘤HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和二硫键偶联物.实验结果显示,LDM等剂量条件下硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组的抑瘤率分别为87.7%和78.0%,二硫键偶联物Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为74.8%和72.3%,游离LDM组为70.9%,相比较长连接键的硫醚键偶联物抑瘤作用显著增强.Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为165.8%和145.2%,Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为82.2%和107.5%,LDM组为71.9%.与二硫键偶联物组比较,硫醚键偶联物组能显著延长荷瘤鼠的生存期;长硫醚键偶联物抗肿瘤作用和对荷瘤动物生存期延长作用强于短硫醚键偶联物.长链硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM肿瘤生长抑制作用提高,荷瘤动物生存期显著延长,有望开发为新的肿瘤治疗药物.
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单链抗体与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化
优化以包涵体形式表达的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白融合蛋白Fv-LDP制备过程.通过单因素或正交设计优化其包涵体制备与溶解、固定化金属螯合层析和分步透析复性过程,Sephadex G-75层析精细纯化蛋白,基于流式细胞术的饱和结合实验检测其抗原结合活性.优化后,Fv-LDP包涵体纯度为63.9％,溶解度为95.7％;纯化后Fv-LDP纯度达95％以上,复性后单体含量占60％,精细纯化后提升为85％,比初始复性条件提高5.6倍,能够与人肺腺癌PAa细胞和肝癌BEL-7402细胞结合.Fv-LDP制备过程被成功优化,为其生产和研发奠定了实验基础,也为其他以包涵体形式表达的基于单链抗体的小型化抗体药物制备提供了比较实用的方法.
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胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点
目的 对比人胚胎干细胞(Hesc)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合Hesc长期体外培养的消化传代方法.方法 将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的Hesc分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存.复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况.结果 用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3 d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时Hes细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率.用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似.分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常.结论 两种酶消化均适用于Hesc培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要.
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抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)联合顺铂的抗肿瘤活性
目的 研究抗Ⅳ胶原酶基因工程单链抗体scFv(3G11)联合顺铂的抗肿瘤效果.方法 明胶酶谱法、Western-blot法研究顺铂对肿瘤细胞分泌Ⅳ胶原酶蛋白的影响,MTT法、实验动物肿瘤模型研究scFv(3G11)与顺铂联合在体外和体内试验中的抗肿瘤效果.结果 顺铂可抑制肿瘤细胞分泌的Ⅳ胶原酶活性,scFv(3G11)与顺铂联合在体外试验中可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,体内试验中对小鼠移植性肝癌H22有显著的抑制作用,药物相互作用指数(CDI值)＜1.结论 scFv(3G11)和顺铂联合应用对肝癌的治疗有协同作用.
关键词： Ⅳ型胶原酶 顺铂 SeFv(3G11) 联合 协同 -
抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab')2与Fab'片段的抗肿瘤作用
目的研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab')2、Fab'片段对小鼠肝癌22(H22)及小鼠Lewis癌肺转移的治疗作用.方法ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用.用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性.结果单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性.单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用.单抗3G11 30 mg/kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51.8%,F(ab')210mg/kg为49.9%,Fab'20mg/kg为39.3%.F(ab')2片段10mg/kg对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率为76%.结论抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠Lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物.
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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFV-M97基因克隆及分泌性表达
目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体.方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×109pfu/ml单链抗体库.对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体.结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732 bp.其中VH 351 bp,编码117个氨基酸;VL 336 bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gly4Ser)3相连.阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20 h,培养液上清中有2 μg/ml可溶性单链抗体.免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力.结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础.
关键词： 单链Fv抗体片段 重组噬菌体表面呈现技术 Ⅳ型胶原酶 肿瘤侵袭肿瘤转移 -
Ⅳ型胶原酶与2型糖尿病大血管病变
2型糖尿病合并大血管病变时,无论在大血管壁或是血浆中Ⅳ型胶原酶均存在较高水平的表达,高水平的Ⅳ型胶原酶可促进动脉粥样硬化的发展,氧化应激和细胞因子在其中起着重要作用.降低Ⅳ型胶原酶成为目前糖尿病治疗的新靶点.
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Ⅳ型胶原酶与糖尿病肾病
Ⅳ型胶原酶作为基质金属蛋白酶家族的成员之一,可降解肾小球基底膜和系膜基质的主要结构成分--Ⅳ型胶原.糖尿病中糖、脂代谢紊乱、血流动力学异常及转化生长因子-8等细胞因子的水平升高,均可使肾小球局部Ⅳ型胶原酶的含量及活性下降,使细胞外基质降解减少,导致肾小球基底膜增厚和系膜基质堆积,在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用.
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人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系
目的探讨人大肠癌转移与Ⅳ型胶原酶的关系.方法应用明胶酶谱分析法(Zymography)检测了31例大肠癌组织Ⅳ型胶原酶的活性,并用RT-PCR方法检测92 kDⅣ型胶原酶RNA的表达情况.结果在伴有转移的大肠癌标本中,Ⅳ型胶原酶的活性形式与非活性形式表达均较高,92 kDⅣ型胶原酶的mRNA与在转移癌中高表达.结论Ⅳ型胶原酶与大肠癌的转移密切相关.
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3,4＇,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷体外抗粘附、抗浸润作用
目的:3,4＇,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷( 3,4＇, 5 - trihydroxystibene- 3 -β- mono- D- glucoside, THMG )抗粘附抗浸润作用及其对大肠癌细胞Ⅳ型胶原酶和整合蛋白α6β4(1aminin)受体的影响.方法:用流式细胞术等细胞生物学技术检测4种大肠癌细胞(HR-8348, Hce-8693, HT29, LoVo)在0.4、0.8、1.6、3.2mmol/L等浓度THMG作用下的粘附率、浸润力、Ⅳ型胶原酶及laminin受体表达.结果:在3.2 mmol/L浓度时THMG对HR-8348、Hce-8693、HT-29、LoVo粘附抑制率分别为75.68%,69.43%,67.55%,78.78%,浸润抑制率分别为82.67%,85.71%,89.65%,92.68%,且随着浓度增大,粘附和浸润抑制率提高.3.2 mmol/LTHMG对HR-8348、Hce-8693、HT-29、LoVo的laminin受体表达抑制率分别是35.12%,36.84%,41.54%,49.57%,对Ⅳ型胶原酶表达抑制率分别为28.75%,30.68%,35.63%,22.03%.粘附抑制与laminin受体表达抑制呈显著性相关(r=0.814,P＜0.01),浸润抑制与Ⅳ型胶原酶表达抑制呈显著性相关(r=0.743,P＜0.05).结论:THMG可能通过抑制癌细胞laminin受体表达而发挥抗粘附效应,THMG抗侵袭效应可能与Ⅳ型胶原酶活性抑制有关.
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肝纤维化时Ⅳ型胶原酶与金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达
目的研究肝纤维化时Ⅳ型胶原酶(MMP-2) 和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在肝组织与贮脂细胞(FSC)中的表达,探讨其对肝纤维化的作用.方法分别从正常和CCl4肝纤维化大鼠的肝组织及FSC中提取RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MMP-2与TIMP-1 mRNA水平.结果正常肝脏FSC不表达MMP-2,仅肝纤维化时才转录;肝组织中无论是正常或肝纤维化时均存在MMP-2 mRNA,并在肝纤维化时表达增加,但无显著性差异(P ＞0 .05).TIMP-1在正常与肝纤维大鼠的肝组织或FSC中均表达,肝纤维化时肝组织和FSC的TI MP-1 mRNA水平与正常相比显著升高(P＜0.05,P＜0.02).结论 FSC表达MMP-2对肝纤维化发生具有重要意义,而TIMP-1表达增加可能是导致肝纤维化过程中胶原降解减少的主要原因之一.
关键词： 肝纤维化 Ⅳ型胶原酶 金属蛋白酶组织抑制因子-1 -
Ⅳ型胶原酶在不同转移潜能的前列腺癌细胞系中的表达及活性分析
目的:探讨前列腺癌细胞转移潜能与Ⅳ型胶原酶基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的关系.方法:应用免疫组织化学SABC法,研究Ⅳ型胶原酶在不同转移潜能的前列腺癌细胞株LNCaP、C4-2B中表达变化.同时采用明胶酶谱法对这2种前列腺癌细胞系分泌的Ⅳ型胶原酶活性进行分析.结果:①免疫组织化学染色显示,LNCaP、CA-2B细胞中均有MMP-2、MMP-9表达,主要表达于细胞质中,C4-2B细胞表达明显强于LNCaP(P＜0.01).②人前列腺癌细胞LNCaP的条件培养液中仅能检测到极低的MMP-2和MMP-9活性,酶谱条带的积分A值分别为0.89±0.02和0.86±0.01,主要以酶原形式存在,而C4-2B细胞则表现较强的MMP-2、MMP-9活性,积分A值分别为96.32±4.36和33.89±1.84,其分泌的MMP-2则以活性形式为主,其分泌量显著高于LNCaP细胞(P＜0.01).结论:前列腺癌细胞中Ⅳ型胶原酶的表达和分泌,有助于癌细胞的侵袭和转移;前列腺癌细胞的侵袭转移潜能与其产生Ⅳ型胶原酶的能力密切相关.
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Ⅳ型胶原及其调节因子表达与喉癌预后的关系
目的探讨声门上型喉癌组织中Ⅳ型胶原及其调节因子一Ⅳ型胶原酶、TIMP-l的表达与预后的关系.方法采用SP免疫组化方法,对3l例声门上型喉鳞状细胞癌标本中的Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶(包括基质金属蛋白酶2、9,MMP-2和MMP-9)及组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的表达进行检测,分析其表达与喉癌病人预后的关系.结果与预后较好的声门上型喉癌相比,预后较差组织中Ⅳ型胶原的表达明显降低(P＜0.01),MMP-9的表达(P＜0.05)及(MMP-2+MMP-9)/TIMP-1比值明显增高(P＜0.01),而MMP-2和TIMP-l在两组间的表达差异无显著性(P＞0.05).结论Ⅳ型胶原及其调节因子的表达与声门上型喉癌病人预后相关,可作为评估预后的参考指标.
关键词： 喉肿瘤 Ⅳ型胶原 Ⅳ型胶原酶 组织基质金属蛋白酶抑制剂-1 预后 -
Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及TIMP-1在喉癌组织中的表达
目的探讨Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)在喉癌组织中的表达及意义.方法应用免疫组化方法对44例喉癌组织及22例喉癌旁正常组织中Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9)及TIMP-1的表达进行了检测.结果与正常组织相比,喉癌组织中Ⅳ型胶原的表达明显降低,MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达明显增高,差别均有显著性意义(P＜0.01);喉癌组织中Ⅳ型胶原表达的阳性率,有颈淋巴结转移者低于无颈淋巴结转移者(P＜0.05),Ⅲ～Ⅳ期低于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05),G 2～3低于G1(P＜0.01);MMP-2表达水平,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05),G2～3高于G1(P＜0.01),No与N1～3间无显著差别(P＞0.05);MMP-9的表达水平,N1～3高于N0(P＜0.05),在Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期、G2～3与G1间无显著差别(均P＞0.05).结论Ⅳ型胶原、Ⅳ型胶原酶及TIMP-1的表达与喉癌进展及其肿瘤生物学行为相关.
关键词： 喉肿瘤 Ⅳ型胶原 Ⅳ型胶原酶 组织基质金属蛋白酶抑制剂-1 -
土贝母皂苷对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞侵袭行为的影响
目的:土贝母[Bolbostemma paniculatum(Maxim.) Franquet]是一种传统中药.我们以前的研究结果已证实从土贝母块茎中分离得到的土贝母皂苷(下称皂苷)有强抗肿瘤效果和诱导肿瘤细胞调亡作用.本研究旨在探讨皂苷对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响.方法:MTT法检测其对PGCL3细胞生长的影响;分别用粘附相关基底膜成分分析试验、重组基底膜侵袭试验、Transwell室趋化运动模型研究皂苷对PGCL3细胞的粘附、侵袭和运动能力的影响;用酶谱法检测皂苷对Ⅳ型胶原酶分泌及活性的影响.结果:皂苷明显抑制PGCL3细胞的生长,且其效果呈剂量依赖关系.皂苷作用PGCL3细胞24、48、72 h的IC50值分别为 16.77、14.62、14.46 μmol·L-1. 皂苷 1.25、2.50、5.00 μmol·L-1 处理PGCL3细胞24 h,对PGCL3细胞侵袭能力的抑制率分别为 20.6%、30.6%、46.8%,对PGCL3细胞运动能力的抑制率分别为 14.2%、24.7%、42.5%.皂苷降低PGCL3细胞Ⅳ型胶原酶的分泌量及Ⅳ型胶原酶活性,降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率,且其效果呈一定的剂量依赖关系.结论:皂苷抑制人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞的粘附、侵袭和迁移能力;皂苷对PGCL3细胞粘附和侵袭的影响与其降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率,降低PGCL3细胞Ⅳ型胶原酶的分泌量及其活性有关.
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腺苷类似物对人高转移卵巢癌细胞侵袭、运动的影响
腺苷类似物抑制PI/PIP磷酸化,升高腺苷酸环化酶活性和cAMP水平、抑制血小板肌动蛋白聚合[1].上述效应可能影响侵袭细胞的生物学性状.肿瘤侵袭涉及细胞运动、粘附与解粘附、水解ECM等.设法抑制或改变上述环节,能干预肿瘤侵袭进程.1 材料和方法1.1 实验材料人高转移卵巢癌细胞(HO-8910PM)[2] 购自上海细胞生物所;在含体积分数为10%灭活小牛血清、1×105 U*L-1青霉素和100 mg*L-1链霉素的RPMI 1640中,37℃、0.05 CO2传代培养.
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Ⅳ型胶原酶对胶质瘤增殖、迁移及侵袭的影响
目的 观察Ⅳ型胶原酶在人脑胶质瘤组织中的表达及其对C6胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的作用.方法 利用Western blot法比较人脑胶质瘤组织和正常组织中Ⅳ型胶原酶的表达量及含量,将体外培养的C6胶质瘤细胞分为3组,分别加入正常培养液(对照组)、Ⅳ型胶原酶(实验组)及Ⅳ型胶原酶+抑制剂GM6001(抑制组),采用噻唑蓝(MTT)实验、细胞迁移实验和细胞侵袭实验,观察Ⅳ型胶原酶对C6胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的作用.结果 胶质瘤组织中Ⅳ型胶原酶的含量(87.5％)显著高于正常脑组织(20.0％).吸光度比值半定量分析结果两组间差异也有统计学意义(0.81 ±0.12比0.04±0.01,P＜0.01).MTT实验显示实验组、对照组和抑制组3组细胞各个时间点吸光度差异无统计学意义(P＞0.05),3组迁移细胞数目分别为(137.49±14.53)、(65.35 ±6.57)、(67.42±7.92)个,实验组同对照组和抑制组差异均有统计学意义(P＜0.05),3组侵袭细胞数目分别为(33.67±7.47)、(20.45 ±4.89)、(21.67 ±5.83)个,实验组同对照组和抑制组差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Ⅳ型胶原酶在人脑胶质瘤组织中表达率及含量明显增高,对于体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞,Ⅳ型胶原酶可显著促进其迁移和侵袭,并通过添加抑制剂GM6001后可有效逆转其迁移和侵袭趋势.
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Wistar大鼠枯否细胞的分离、鉴定与培养
目的 改良、完善枯否细胞(Kupffer cell,KC)的分离培养方法.方法 选用健康SPF级Wistar雄性大鼠,采用原位灌注后再采用0.05％Ⅳ型胶原酶离体灌注的方法,经过25％和50％ percoll密度梯度离心提取KC.光学显微镜观察细胞形态,台盼蓝鉴定细胞活力,墨汁吞噬实验及免疫细胞化学染色法鉴定细胞纯度.结果 大鼠KC细胞数为3.15×107个.经过台盼蓝染色后,显示细胞活力为95％.细胞纯度为96％.结论 该研究方法简单,可行.尽量减少分离过程中对肝脏KC的损害和丢失,缩短操作时间,保证细胞数量、纯度及活力,终形成一套较经济实惠、方便简洁、效果较佳的实验方法.
