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酶联免疫吸附法测定三种CTB与其受体GM1的亲和性
霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌产生的相对分子质量为84 kD的肠毒素,由1个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成.CTA(大约28 kD)为毒性亚单位,CTB(大约12 kD)为无毒的受体结合亚单位,可以和所有有核细胞膜上的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)结合.CTA则通过CTB与GM1的结合作用得以进入细胞发挥其毒性级联反应[1,2].目前,CTB已作为载体蛋白广泛用于基础研究.本文采用ELISA法测定了两种国产CTB与其受体GM1之间的亲和性,并与国际标准品CTB进行了比较.
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益气健脾药物血清对离体脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合作用的影响及机制
目的:观察益气健脾药物血清对离体脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合作用的影响并探讨其相关机制.方法:采用血清药理学方法和放射配基受体结合测定技术分别对正常、脾虚、药物血清作用后的大鼠壁细胞结合位点数进行检测,并对补中益气汤含药血清抑制大鼠胃泌素与其受体结合的抑制率进行了测定.结果:脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体结合容量明显少于正常大鼠(876.0±88.2 vs 1 071.1±102.1,P<0.01);补中益气汤药物血清作用后结合位点数明显上升(980.4±89.2 vs876.0±88.2,P<0.05);党参及白术药物血清组作用后结合位点数也有上升趋势,但与脾虚组相比差异不显著;补中益气汤含药血清部分抑制大鼠胃泌素与其受体的结合(抑制率=42.9%>30%).结论:益气健脾药物血清对脾虚大鼠的结合位点数下降具有上调作用;其机制可能与其同胃泌素受体的竞争结合相关.
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幽门螺杆菌外膜和甲硝唑的结合与耐药性的关系
目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pyroli)外膜和甲硝唑的结合作用与耐药性的关系.方法:运用亲和黏附酶反应法,观察H.pylori外膜和甲硝唑结合作用,并对比敏感菌和耐药菌与甲硝唑结合作用的差异:运用甲硝唑亲和层析柱和SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳对比敏感菌和耐药菌的甲硝唑结合蛋白.结果:H.pylori外膜存在甲硝唑的特异性结合位点,其结合作用能被高浓度甲硝唑竞争性抑制(P<0.001),耐药菌外膜与甲硝唑的结合作用明显低于敏感菌(P=0.0012).结论:H.pylori外膜对甲硝唑结合作用降低与甲硝唑耐药性的产生有关.
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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白E-19的研究
目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为其与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接人酵母表达载体p GBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析.并根据GenBank中的序列信息设计引物从并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀方法再次验证二者之间的结合作用.结果:成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能使X-α-gal变成蓝色的真阳性菌落39个,其中有5个未知基因,在genbank中未找到同源序列,在HepG2细胞的mRNA中成功扩增出该基因的全序,体外免疫共沉淀方法证明HBeAg与新基因E-19表达的蛋白质在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBeAg的肝细胞结合蛋白,发现与HBeAg有相互作用的未知蛋白新基因,为HBeAg的功能研究提出新线索.
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乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究
目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体.HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列,体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用.
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关于西酞普兰的研究概况
西酞普兰系二环酞酸的衍生物,化学结构上与其他任何抗抑郁药物明显不同.资料显示西酞普兰是选择性强的5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂,其对5-HT再摄取的阻滞作用比对去甲肾上腺素强3 400倍,比多巴胺强20 000倍.其与乙酰胆碱、组胺、去甲肾上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸及阿片受体结合作用轻微.
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茜草与欧茜草薄层色谱法鉴别
茜草Rubia cordifolia L.是常用中药,有凉血、止血、祛瘀、通经之功效[1].茜草制剂能治疗膀胱结石.其同属植物欧茜草R. tinctorum L.(德国产)是用于治疗肾结石的药物消石素处方中的主药.但由于欧茜草中含有芦西丁(lucidin),有较强的致基因突变、细胞转化[2]及DNA结合作用[3],因此美国FDA已明确将其列为禁用药物.茜草在中国的大部分地区均有分布,对中国产茜草和欧茜草进行化学研究,有助于扩大中国茜草的适用范围.
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动脉粥样硬化中医辩证论治研究进展
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是心脑血管病的主要病理基础,目前关于As的病因较一致的看法是,由损伤、炎症、免疫功能障碍三者相结合作用的结果.
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中药抗AS在调节炎症因子方面的研究进展
近年来心脑血管疾病成为我国发病率和死亡率高居第一的疾病,其主要病理基础之一是动脉粥样硬化(AS).现代医学关于AS的病因较一致的看法是由损伤、炎症、免疫功能障碍三者相结合作用的结果[1].本文就近年来中药干预炎性因子方面的研究进展侧重几个方面综述如下.
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甲苯二异氰酸酯对DNA分子的损伤作用
甲苯二异氰酸酯(TDI)是异氰酸酯类化合物中常使用的一种,主要应用于聚氨酯树脂泡沫、油漆、涂料、塑料等工业生产中.长期接触和使用,可造成对人体的呼吸系统、免疫系统、内分泌系统、皮肤等损害,尤其是呼吸系统,是引起职业性哮喘的主要原因之一[1].近年来甲苯二异氰酸酯的遗传毒性日益受到人们的关注.本文拟用紫外吸收光谱位移法,观察甲苯二异氰酸酯与DNA分子的结合作用,用高效液相色谱法分析甲苯二异氰酸酯与DNA的结合位点,探讨其遗传毒性的分子机制,为评价甲苯二异氰酸酯毒性提供根据.
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从蛋白质相互作用研究方法的发展看人们认识事物的过程
1 酶联免疫吸附检测法简单的研究两蛋白质相互作用的是,在体外验证两蛋白质的相互作用,如验证所制备的抗体是否特异性地与抗原结合,这里要求方法:一要能检测到结合作用,二要排除非特异性结合,这样人们就建立了酶联免疫吸附检测法(ELISA).原理是,将已知抗原固定在96孔塑料板上,用不同稀释度的抗抗原的第一抗体溶液与其结合,经洗涤去除非特异性结合分子后,加入用辣根过氧化物酶标记的抗第一抗体的第二抗体,洗涤后再加入辣根过氧化物酶的底物,底物被酶作用后就转变为有颜色的物质.这样只有在第一抗体与抗原结合了之后才会有后面的二抗和底物的逐步结合,也才会有颜色的变化.由于这种方法是用酶标二抗和底物呈色,所以有放大效应,灵敏度较高.若抗体的特异性和亲和性非常好,ELISA法就可以用来检测实验样品和临床标本中的抗原水平,例如,临床上乙型肝炎5项指标的检测就是用这种方法.
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人核迁移蛋白C与血小板生成素受体MPL的结合作用
目的 研究人核迁移蛋白C(hNUDC)与血小板生成素受体MPL的结合作用.方法 采用PCR技术.分别从人胚胎十细胞和pLexA-MPL-EC质粒中扩增hNUDC和MPL-EC基因,再分别克隆至pET-28b(+)和pMAL-c2表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达hNUDC和MPL-EC蛋白.纯化后,通过MBP pull-down试验检测二者的结合作用.结果 表达的融合蛋白His-hNUDC和pMAI-MPI-EC表达量分别约占菌体总蛋白的25%和30%,蛋白回收率分别可达90%和80%.纯化后的蛋白纯度分别在95%和90%以上,且均具有良好的反应原性.His-hNUDC蛋白可与MBP-MPL-EC蛋白共洗脱,二者存在结合作用.结论 hNUDC蛋白可与MPL蛋白结合,可能为MPL的一种新配体.
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饮用水中邻苯二甲酸二-2-乙基已酯的测定
环境内分泌干扰物质(Environmental endocrine disruptors,EDs)是指一些可影响负责机体自稳、生殖、发育和行为的天然激素的合成、分泌、转运、结合作用或消除的外源性物质[1].此类物质具有亲脂性,不易降解,易挥发,残留期长等特点,可通过生物富集和食物链的放大作用引起体内富集.人群流行病学调查显示,人类的生殖障碍、发育异常及某些癌症如乳腺癌、卵巢癌等都与环境内分泌干扰物质有关[2].因此,环境内分泌物质的污染问题受到了多个国家的关注.
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刚地弓形虫主要表面抗原(SAG1)与宿主细胞结合作用的体外分析
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光谱法研究野漆树苷与人血清蛋白的结合作用
目的 研究野漆树苷与人血清蛋白(HSA)的结合作用及机制.方法 通过光谱法研究野漆树苷与HSA的作用机制.以能量传递原理及Lineweaver-Burk双倒数方程计算野漆树苷与HSA 反应的结合常数和结合距离;以热力学参数判断其与HSA 间的作用力类型;以同步荧光光谱考察野漆树苷对 HSA 构象的影响.结果 野漆树苷与HSA 反应的结合常数随温度的升高而降低;野漆树苷与HSA之间的结合距离为4.16 nm;野漆树苷与HSA的互相作用以氢键和范德华力结合为主;酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰随野漆树苷浓度的增加而产生猝灭.结论 野漆树苷能与HSA结合,其荧光猝灭以静态猝灭为主.
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铁卟啉与O2、N2、NO结合后的金属自旋状态分析
通过半经验量子化学计算软件 MOPAC2012 研究血红蛋白中铁卟啉与3种气体分子O2、NO和N2 在低、中、高3种自旋状态下的结合作用,计算体系中的基本机构参数和总能量变化,分析自旋状态在血红蛋白中结合气体分子的作用. 铁卟啉结合O2 分子时,在高自旋状态时结合能低,为-96. 19 kJ/mol;结合N2 分子时,在低自旋状态时结合能低,为-48. 87 kJ/mol;结合NO分子时,在低自旋状态时结合能低,为-85. 60 kJ/mol.
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热压伤42例护理
热压伤是热力和压力的复合损伤[1],两者结合作用对组织结构及功能的损害比单独热烧伤更严重.热压伤伤情严重程度主要取决于温度高低、压力大小和持续时间长短.其特点是损伤的创面较小,但深度较深,处理不当常常加重损伤,影响功能.因此,对患者进行积极的治疗外,护理工作也十分重要.2009年5月至2011年5月我科收治热压伤患者共42例,经精心治疗护理,取得满意疗效.现报告如下.
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吖啶药物与血清蛋白的相互作用研究
应用荧光谱法,研究(N-(N-(2-(4-吗啉)乙胺)-4-酰胺吖啶)-α-丙氨(MACA)与血清白蛋白(HSA)的相互作用,确定MACA-HSA的静态荧光猝灭机制和疏水力相互作用,系统考察MACA与HSA的结合常数、结合位点数、热力学函数,两者在不同温度下的结合常数分别为2.51×105(298K)、1.78×105(308K)、1.32×105(318K);结合位点数分别为1.05、1.08、1.10,MACA和HSA结合作用的AH和△S分别为-25.39kJ·mol-1和18.20 kJ·mol-1.
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压力蒸汽灭菌生物指示菌检测失败原因分析
压力蒸汽灭菌生物指示菌检测是目前用于监测灭菌效果可靠、直接的方法.它是在压力蒸汽灭菌的时间、温度、压力、饱和蒸汽的适量结合作用后(如煮沸100℃细菌死亡时间为300min;压力蒸汽121℃细菌死亡时间是12min,132℃为2min;干热160℃为30min,180℃为5min),在溴甲酚紫葡萄糖培养基上,56℃培养细菌生长24~48h后观察培养基颜色,由紫色变成黄色表明培养阳性,有菌体生长;不变色表明培养阴性,无菌体生长,灭菌质量符合标准.