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苯并[a]芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立
目的 建立苯并[a]芘(B[a]P)作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法.方法 使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白,同步使用高效液相色谱技术和双向电泳技术对蛋白进行分离,再进行MALDI-TOF-MS/MS鉴定,比较两种分离方法鉴定蛋白的差异,并将鉴定蛋白的氨基酸序列与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白的保守序列进行比对.结果 通过高效液相色谱分离结合质谱鉴定找出3个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定找出12个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定方法存在明显优势;所鉴定蛋白存在与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白相似的保守序列.结论 免疫共沉淀蛋白双向电泳分离结合质谱鉴定方法可用于分析ADP-核糖基化修饰蛋白,并发现ADP-核糖基化蛋白存在相对保守的结合序列.
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HPLC、HPLC－MS 在经方成分分析及 Co－IP、激光共聚焦在经方药理机制研究中的应用
经方用药精妙、临床疗效卓越，为历代医家所尊崇，也是科学研究者的重点研究对象。经方药物组成多样、成分复杂。经方的现代研究面临药理作用机制复杂、有效成分不明确等问题，从而制约了经方在现代医学领域的推广以及国际化的进程。 HPLC及HPLC－MS联用技术广泛被应用到药物的分析、质控，同样适用于经方的成分分析。文章介绍了HPLC及HPLC－MS联用技术在经方成分及含量的鉴定中的应用，包括经方样品的前处理、经方成分的定量、定性分析以及经方的药物代谢研究等方面。免疫共沉淀技术可用于检测经方对蛋白之间的相互作用的影响，激光共聚焦技术可用于观察经方对蛋白、离子等的分布、转移的影响。结合免疫共沉淀与激光共聚焦技术，能更好地解析经方药理作用的分子机制，因此，文章对免疫共沉淀及激光共聚焦技术在经方现代药理研究中的应用也进行了介绍。
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免疫共沉淀技术的应用研究
免疫共沉淀技术是研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的重要方法之一，可以确定在生理状态下细胞内相互作用的蛋白质。在蛋白复合物的研究中，不仅可以用于验证其存在，还可以发现新的蛋白复合物。近来，中医药科研工作者应用此技术来揭示中医药的作用机制，取得了一些成绩。就近几年免疫共沉淀技术的应用研究做文献综述。
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低氧预适应小鼠脑海马组织内与cPKCγ相互作用的ERK1/2磷酸化水平降低
目的 探讨与经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)相互作用的细胞外信号调节激酶1//2(ERK1/2)的磷酸化水平在小鼠脑低氧预适应形成过程中的变化.方法 用成年雄性BalB/c小鼠制备整体低氧预适应模型,将小鼠随机分为正常对照(H0)、早期低氧预适应(H3)和延迟性低氧预适应(H6)3组.应用免疫共沉淀,Western blot等方法检测胞质和膜相关成分中与cPKCγ相互作用的ERK1/2的磷酸化水平.结果 小鼠海马组织中ERK1/2能与cPKCγ免疫共沉淀,且与HO组相比,H3及H6组ERK1/2的204位酪氨酸磷酸化水平明显降低(P<0.05).结论 小鼠海马组织中,cPKCγ与ERK1/2存在相互作用,且可能参与了脑低氧预适应的发生和发展.
关键词： 脑低氧预适应 蛋白激酶C 细胞外信号调节激酶1/2 免疫共沉淀 -
神经接头蛋白Dok6下游作用蛋白的鉴定及初步功能分析
目的 Dok6下游作用蛋白的鉴定和初步功能分析.方法 利用anti-Dok6的抗体进行免疫共沉淀实验,然后通过Western blot,银染分析,质谱鉴定以及后续的生物信息学预测及分析其潜在的生理功能.结果 本实验得到了26个可能与Dok6发生直接或间接相互作用的蛋白,这些蛋白分别参与了体内众多的生理过程.为了缩小研究范围,选取了与神经系统发育及细胞内信号传导相关的9个蛋白作为研究对象进行后续的功能研究.结论 通过质谱鉴定以及生物信息学综合分析得到的潜在Dok6下游蛋白将给研究Dok6的生理功能及阐述其相关分子机制提供重要的依据.
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大鼠脂肪细胞中14-3-3蛋白与葡萄糖转运子4的相互作用
目的 研究在大鼠脂肪细胞中,14-3-3蛋白与葡萄糖转运子4(GLUT4)之间是否存在相互作用.方法 用胶原酶Ⅰ消化雄性SD大鼠附睾上的脂肪垫,获得分离的脂肪细胞.在纯化的细胞中,采用低渗裂解和甘油梯度速率沉降技术获得3个含有GLUT4的组分:T、H和L.用交联了1F8(GLUT4特异性单抗)的琼脂糖微珠对脂肪细胞总提取物以及上述3个组分分别进行免疫吸附实验,经吸附后在上清液和微珠的洗脱液中分别进行14-3-3蛋白和GLUT4的免疫印迹分析.结果 在脂肪细胞的总提取物以及上述GLUT4的3个组分T、H和L中,14-3-3蛋白都能够与GLUT4发生免疫共沉淀.共沉淀下来的14-3-3蛋白在免疫印迹分析时显示为2个条带,其相对分子质量分别约为29 ku和60ku,提示14-3-3蛋白可能以二聚体的形式与GLUT4发生相互作用.结论 在生理条件下,14-3-3蛋白与GLUT4在大鼠脂肪细胞中存在相互作用.
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Par6A cDNA的克隆与表达
目的 探讨Par6A基因的克降表达及功能.方法 用RT-PCR从大鼠L6骨骼肌细胞扩增出Par6A的cDNA,利用分子克隆的方法 构建Par6A的克隆载体以及真核表达载体,在293细胞中进行表达,通过免疫共沉淀初步研究Par6A的功能.结果 成功扩增出Par6A cDNA,片断大小约1 kb,并构建了真核重组表达质粒pDsRed-Express-N1-Par6A.在转染293ET细胞24 h后,荧光显微镜下可见红色荧光的表达.免疫共沉淀实验表明Par6A与PKCζ存在相互作用.结论 成功扩增出大鼠骨骼肌的Par6A cDNA,为研究Par6A的相关功能奠定了基础.
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柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与微线蛋白-2相互作用的鉴定
目的 研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用. 方法 以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况.原核表达 GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验.同时构建真核表达载体pcDNA3.1-His- EtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验.在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况. 结果 诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/ pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行 GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用. 结论 通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(Et- MIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础.
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刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定
目的 从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白. 方法 分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GST-MIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析. 结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35～45 ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白. 结论 经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶.
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红细胞血红蛋白释放实验与免疫共沉淀联用分析人红细胞内血红蛋白与其他蛋白的相互作用
目的:通过红细胞血红蛋白电泳释放实验(ERT)与免疫共沉淀,寻找红细胞内与血红蛋白(hemoglobin,Hb)相互作用的蛋白.方法:首先将正常成人新鲜抗凝全血制备成红细胞悬液和溶血液,通过电泳释放实验分别分离并得到红细胞HbA(RA)和溶血液HbA(HA),将此区带从凝胶中分别切出,经过反复冻融后,将上清吸出并进行浓缩,然后用hemoglobinβ antibody(37-8) AC通过免疫共沉淀的方法,分别从红细胞裂解液、RA和HA中捕获血红蛋白复合物,然后利用5％-12％的SDS-PAGE分离上述复合物,并用Q-TOF质谱对目的区带进行鉴定.结果:HbA成分经hemoglobinβ antibody(37-8) AC免疫共沉淀捕获的复合物包含有16、20、22、28、50 kD 5条明显的区带,经质谱鉴定分别为血红蛋白、Band 3蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prx2)、Band 3蛋白和β-actin蛋白、Band 3蛋白.结论:在人红细胞内,血红蛋白HbA可能与Prx-2、Band 3蛋白、β-actin蛋白之间存在相互作用,并形成复合体.
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日本脑炎病毒受体74×103分子的分离与初步鉴定
目的 分离和初步鉴定口本脑炎病毒(JEV)易感细胞C6/36和Vere细胞上受体分子.方法 应用免疫共沉淀(Co-IP)技术,从C6/36和Vero细胞分离与JEV结合的受体分子,做质谱分析鉴定和Western blot检测.用激光共聚焦技术(LSCM)观察候选受体分子在细胞膜上的定位及与JEV结合的情况.结果 经过Co-IP反应,从C6/36、Vem细胞上分离出多个与JEV结合的分子条带.质谱分析首次鉴定出一个蛋白,即C6/36细胞上与JEV结合的相对分子质(Mr)为74×103分子,为HSC70蛋白.进一步用抗HSC70抗体做Western blot,榆测剑从C6/36和Vem细胞膜上Co-IP分离出的74×103蛋白.LSCM观察到JEV吸附在C6/36细胞膜上时,HSCT0蛋白与JEV共定位.结论 C6/36细胞上Mr为74×103的HSC70可能是JEV的受体分子.
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肌动蛋白样分子参与TNFRⅡ介导的TM-TNF-α杀瘤活性的研究
目的寻找并研究参与TM-TNF-α杀瘤的协同分子,进一步揭示TM-TNF-α发挥生物学作用的特征,阐明其与S-TNF-α功能差异的分子机制. 方法利用免疫共沉淀法、质谱分析、Western blot及细胞毒实验探索参与TM-TNF-α杀瘤功能的协同作用分子并确定其性质. 结果 TM-TNF-α免疫共沉淀产物中发现一相对分子质量(Mr)为43×103蛋白分子,用质谱分析及Western blot证实该分子属于肌动蛋白家族;用抗肌动蛋白抗体封闭效应细胞和/或靶细胞后,TM-TNF-α对主要表达TNFRⅡ的肿瘤细胞HL-60的杀伤作用显著下降,而对主要表达TNFRⅠ的肿瘤细胞MCF-7则无影响. 结论 Mr为43×103的肌动蛋白样分子可能参与并增强TM-TNF-α通过TNFRⅡ介导的杀瘤功能.
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RASAL1基因启动子甲基化及RAS活性与结肠癌临床病理的关系
目的:检测RASAL1(ras GTPase-activating-like protein 1)基因甲基化率及RAS活性在人结肠癌组织中的表达,探讨其与临床病理资料间的关系.方法:以40例结肠癌标本为研究对象,相应的正常组织标本为对照.甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测RASAL1启动子CpG岛甲基化状态,免疫共沉淀法检测RAS活性,分析肿瘤组织中RASAL1基因甲基化率及RAS活性与临床病理参数间的关系.结果:40例肿瘤组织中有26例检测出RASAL1基因甲基化(26/40,67.5％),对照组40例中有12例出现甲基化(12/40,30％),肿瘤组织甲基化率明显高于正常组织(P=0.0017).肿瘤组织中RAS活性的中位数为1.07,正常组织中RAS活性的中位数为0.52,P＜0.001,差异有统计学意义.结肠癌组织中RASAL1基因的甲基化率、RAS活性与患者肿瘤分化程度、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期有统计学差异(均P＜0.05).结论:RASAL1甲基化状态与RAS活性增加有关,可能在结肠癌的发生发展中起重要作用.抑制RASAL1甲基化及RAS活性,可能成为治疗结肠癌的新靶点.
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乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究
目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体.HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列,体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用.
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增生性瘢痕成纤维细胞中分泌型凋亡相关蛋白1相互作用蛋白的研究
目的 寻找与分泌型凋亡相关蛋白1 (secreted apoptosis-related protein1,SARP1)存在相互作用的蛋白质分子,分析其分子机制.方法 成功构建的重组SARP1腺病毒载体Ad-SARP1,转染进入原代培养的增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb).免疫共沉淀法沉淀出蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,用考马斯亮蓝染色,对SDS-PAGE胶上切取的电泳蛋白条带进行酶解与质谱分析,根据质谱分析获得的肽序列谱图自动进行数据库搜索.结果 在阳细胞对照组和导入Ad-SARP1感染的细胞当中,均共沉淀出7条蛋白带,相对分子质量分别约为93×103、43×103、40×103、37×103、31×103、26×103和12×103;在未加SARP1抗体组则没有沉淀出蛋白条带.分析蛋白条带得到6个可能与SARP1有相互作用的蛋白,分别为骨膜蛋白前体(periostin precursor或OSF-2)、牙周韧带相关蛋白1(asporin precursor或PLAP1)、磷酸甘油激酶1(phosphoglycerate kinase 1)、未知蛋白rCG50690、载脂蛋白(apolipoprotein A-I,Apo-AI)、硫氧还蛋白1(thioredoxin 1,TRX1).结论 通过免疫共沉淀法结合液相色谱/质谱联用离子阱检测技术,可以获得SARP1的相互作用蛋白,为研究SARP1调控HSFb凋亡信号通路的作用机制提供了新的线索.
关键词： 分泌型凋亡相关蛋白1 增生性瘢痕 成纤维细胞 免疫共沉淀 相互作用蛋白 -
Stathmin与间隙连接蛋白26相互作用并在小鼠耳蜗表达
目的 筛选和鉴定连接蛋白26(connexin 26,CX26)的相互作用蛋白质,分析其在小鼠内耳的表达,探讨与听觉的关系.方法 酵母双杂交技术筛选CX26的相互作用蛋白质.在体外真核细胞表达系统HEK293细胞内过表达人CX26和相互作用蛋白质,观察它们的定位,并用免疫共沉淀实验观察在体外真核细胞中是否存在相互作用.进一步在小鼠脑组织中用免疫共沉淀方法验证CX26和相互作用蛋白质在真核生物体内的相互作用.逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分析相互作用蛋白质在小鼠耳蜗的表达.结果 酵母双杂交实验筛选和鉴定到stathmin与CX26相互作用,两者在体外过表达系统HEK293真核细胞中有共定位,免疫共沉淀实验证实在体外真核细胞和真核生物体内存在相互作用,而且stathmin在小鼠耳蜗表达.结论 stathmin与CX26相互作用,并且在小鼠耳蜗表达.
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泛素连接酶Smurf1促进PDK1的多聚泛素化修饰
目的 探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)发生多聚泛素化修饰的机制.方法 免疫共沉淀(CO-IP)和免疫印迹(WB)分析PDK1的多聚泛素化修饰,MEF细胞内印证泛素连接酶Smad泛素化修饰调节因子1 (Smurf1)增强PDK1多聚泛素化修饰,定点突变和CO-IP及WB确定PDK1多聚泛素化修饰位点.结果 PDK1可发生多聚泛素化修饰,泛素连接酶Smurf1增强PDK1多聚泛素化修饰,且依赖HECT类泛素连接酶Smurf1 K699位点活性;K304是PDK1多聚泛素化修饰位点.结论 泛素连接酶Smurf1增强PDK1的多聚泛素化修饰.
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一种新的抗辐射性相关蛋白AA12和CHK1相互作用研究
目的:研究AA12蛋白与CHK1蛋白的相互作用.方法:用在大肠杆菌中表达纯化的AA12(LG21)蛋白制备多克隆抗体,Western印迹检测抗体的特异性;用自制的抗体在A1-5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验;同时将AA12与Chk1基因克隆入酵母双杂交载体中,将重组质粒导入酵母菌AH109中,检测报告基因的表达情况.结果:Western印迹结果表明该抗体可以与AA12蛋白特异结合;并用免疫共沉淀实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在哺乳动物细胞体内的相互作用.同时用酵母双杂交实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在酵母体内的相互作用,β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果均为阳性.结论:AA12蛋白和CHK1蛋白之间存在相互作用,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础.
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关键词：
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应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白
目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证.方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用.结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1.成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达.免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用.结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证.
关键词： 酵母双杂交 DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位 磷酸化簇 相互作用 免疫共沉淀
