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肌动蛋白样分子参与TNFRⅡ介导的TM-TNF-α杀瘤活性的研究
目的寻找并研究参与TM-TNF-α杀瘤的协同分子,进一步揭示TM-TNF-α发挥生物学作用的特征,阐明其与S-TNF-α功能差异的分子机制. 方法利用免疫共沉淀法、质谱分析、Western blot及细胞毒实验探索参与TM-TNF-α杀瘤功能的协同作用分子并确定其性质. 结果 TM-TNF-α免疫共沉淀产物中发现一相对分子质量(Mr)为43×103蛋白分子,用质谱分析及Western blot证实该分子属于肌动蛋白家族;用抗肌动蛋白抗体封闭效应细胞和/或靶细胞后,TM-TNF-α对主要表达TNFRⅡ的肿瘤细胞HL-60的杀伤作用显著下降,而对主要表达TNFRⅠ的肿瘤细胞MCF-7则无影响. 结论 Mr为43×103的肌动蛋白样分子可能参与并增强TM-TNF-α通过TNFRⅡ介导的杀瘤功能.
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87位氨基酸在TM-TNF-α诱导靶细胞凋亡中的作用
目的研究TM-TNF-α分子结构与功能的关系,阐明其诱导靶细胞凋亡的分子机制. 方法构建定点突变的87/Phe TM-TNF-pcDNA3.0,并瞬时转染Cos-7细胞,利用MTT法,annexin Ⅴ,Western blot检测TM-TNF-α突变体的胞毒效应,对靶细胞死亡方式及对核转录因子NF-κB转位的影响. 结果 87位氨基酸置换后,TM-TNF-α对靶细胞的杀伤率无明显改变,但TM-TNF-α突变体通过促进NF-κB核转位,诱导靶细胞死亡的方式由凋亡转为坏死. 结论 87位氨基酸是TM-TNF-α诱导靶细胞凋亡的关键氨基酸残基,其所在的结构域可能是诱导凋亡的功能域.
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TM-TNF-α介导的反向信号下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达
目的:观测TM-TNF-α介导的反向信号对sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的影响,构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变体,并进一步验证.方法:sTNF-α激活U937细胞后撤除,加入可溶性TNFR(sTNFRⅠ)激活TM-TNF-α介导的反向信号,用RT-PCR方法检测反向信号对活化后U937细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA的影响;采用分子克隆技术构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体,采用电穿孔法转染U937,并用Western blot检测蛋白表达.结果:sTNF-α激活U937细胞后撤除,高表达的细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA随着时间的延长而逐渐降低;sTNFRⅠ激活的TM-TNF-α介导的反向信号可加速细胞因子mRNA的降解,且使mRNA降解至50%的时间分别由约75、60分钟缩短至约45、35分钟.成功构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体pcDNA3.0-ΔcsTM-TNF-α并瞬时转染U937细胞,Western blot结果显示U937细胞膜表面除表达26 000的野生型TM-TNF-α蛋白外,还可表达约20 000的突变体蛋白.这种缺失胞浆段的突变体蛋白可竞争性抑制反向信号对活化后U937细胞因子mRNA的下调作用.结论:TM-TNF-α介导的反向信号可下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达;且TM-TNF-α胞浆段为其介导的反向信号所必需.
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ICAM-1协同参与TNFRI介导的TM-TNF-α杀瘤作用
目的:寻找协同参与TM-TNF-α杀瘤作用的膜表面分子, 探讨TM-TNF-α杀瘤及两型TNF-α生物学效应差异的分子机制. 方法:利用抗体封闭实验及RT-PCR, 检测ICAM-1及VCAM-1对TNFR1或TNFRII介导的TM-TNF-α杀瘤效应是否具有协同作用. 结果:封闭表达TNFR I的MCF-7细胞表面的ICAM-1, 可显著降低TM-TNF-α对其杀伤的作用; 而封闭VCAM-1无明显效应.封闭表达TNFR II的HL-60细胞表面的ICAM-1或VCAM-1, 均对TM-TNF-α的杀伤作用无影响.结论:ICAM-1对于TM-TNF-α通过I型受体介导的杀瘤效应具有协同作用.
