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肺癌靶向通用载体hu3D3/cSA融合蛋白的制备和活性分析
目的 制备一种新型的肺癌靶向通用载体hu3D3与核心链霉亲和素(core-streptavidin,cSA)的融合蛋白hu3D3/cSA,并鉴定其活性.方法 PCR扩增cSA基因,克隆至质粒hu3D3/pET-22b(+)而获得表达载体hu3D3/cSA/pET-22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化hu3D3/cSA融合蛋白,采用TEA缓冲液进行复性.SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白四聚体的形成.FITC标记hu3D3/cSA,通过荧光显微镜分析hu3D3组分的抗原反应性和特异性,流式细胞术比较hu3D3/cSA和hu3D3与靶点的结合能力;ELISA和Western blot鉴定cSA组分结合生物素(biotin)的能力.结果 获得序列正确的hu3D3/cSA/pET-22b(+)重组子,融合基因在E.coli BL21(DE3)中主要以包涵体的形式表达.纯化复性后的融合蛋白能够形成四聚体复合物,保留了cSA结合生物素的活性,hu3D3组分能与肺癌细胞表面抗原结合,且结合能力与单体hu3D3相比有明显增强.结论 成功制备了具有结合靶抗原和生物素活性的hu3D3/cSA融合蛋白,同时改善了hu3D3组分结合其靶点的亲合力(avidity).因此,hu3D3/cSA可以作为一个通用的肺癌靶向载体,与多种生物素化的抗肿瘤药物或试剂联用,有望为多药物联合靶向治疗肺癌提供一种可行的方法.
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人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析
目的 为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH的功能性亲和力,制备其二价和四价的抗体分子.方法 重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,而获得同源二聚体dihu3D3VH和同源四聚体tehu3D3VH基因.将两种基因克隆至pET-22b(+)表达载体,并分别在E.coli BL21(DE3)中表达.表达产物通过N2+亲和层析柱纯化.用FITC分别标记hu3D3VH、dihu3D3VH和tehu3D3VH三种抗体分子,通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性,并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力.结果 两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达,纯化并复性后,其蛋白溶液中分别存在约50%的二聚体和70%的四聚体.dihu3D3VH和tehu3D3VH均保留了hu3D3VH的抗原反应性和特异性;且与hu3D3VH相比,其功能性亲和力分别提高了约60%和160%.结论 采用增加结合价的策略,有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力.
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抗TNF-α骆驼化人源sdAbs库的构建及筛选
目的 探索有效的抗体稳定性改构策略,筛选制备抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)稳定、高亲和力人源抗体.方法 基于定点突变技术和核糖体展示技术,对人源抗体片段VH进行骆驼化稳定性改构,构建骆驼化人源单域抗体(single-domain antibodyies,sdAbs)库,以TNF-α作为筛选抗原,筛选特异骆驼化人源sdAbs.结果 以前期构建的人源VH/K基因库为模板扩增VH基因;采用定点突变方法,将VH基因FR2中的4个疏水性氨基酸突变为亲水性氨基酸构建人源骆驼化sdAbs基因库;基于核糖体抗体库技术,构建用于核糖体展示的sdAbs基因库;经体外转录翻译后,以重组TNF-α作为筛选抗原,采用亲和富集法淘选特异性抗体基因;将筛选富集mRNA的RT-PCR基因产物克隆,并在原核系统pET-22b( + )/BL21(DE3)中实现可溶性表达,表达产物经ELISA鉴定,确认具有极高ELISA值的阳性克隆12、40,其序列分析表明是全新的抗TNF-α人源sdAbs;抗原特异性结合活性实验显示两者均可以特异性识别TNF-α,而不能与狂犬病毒糖蛋白和BSA结合,表明它们是特异针对TNF-α的人源基因工程抗体,而且均有很好的抗原浓度依赖性.结论 该研究将抗体稳定性的定向改造法和进化方法相结合,筛选得到了具有较好抗原特异性和良好稳定性的人源抗体,为稳定性人源抗体的制备提供了理论依据及技术基础.
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骆驼来源单域抗体的研究进展
骆驼科动物的血清中存在一种只含重链的同型二聚体(homodimer)构成的特殊抗体,这类抗体由1个重链可变区和2个恒定区(CH2和CH3)组成,缺少CH1和轻链.由该类抗体重链可变区筛选制备而得到的抗体称为单域抗体.单域抗体较常规抗体具有相对分子质量小、热稳定性强、易通过血脑屏障等优点,越来越多地应用于生物探测、诊断、制药等领域.本文主要阐述了单域抗体的结构特征、理化性质及其在生物医学领域的应用.
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基于计算生物学方法的小容量单域抗体库的构建及食品中雌二醇特异性抗体的筛选
目的 构建骆驼源单域抗体实体库和虚拟库,为快速筛选检测食品中小分子污染物的特异性抗体提供新方法.方法 通过基因克隆、一代测序、同源性分析的方法构建骆驼源单域抗体基因库,通过二级结构分析和同源建模的方法建立单域抗体的三维结构虚拟库,利用分子对接技术实现雌二醇特异性抗体的虚拟筛选,并以雌二醇小分子为靶标进行初步验证.结果 构建的小容量单域抗体库含有2000株抗体,每一株抗体的遗传背景、蛋白质结构及抗体抗原互补决定区(CDR)的信息清晰;通过分子对接得到结合雌二醇小分子能力高的一株抗体的半经验结合自由能绝对值为9.56;相互作用分析结果显示,单域抗体结构中和雌二醇小分子发生相互作用的主要为3个CDR区形成的loop结构,经间接ELISA验证,其和雌二醇结合的50％抑制率(IC50)值为20 ng/ml,检测限(LOD,IC1o)为4.097 ng/ml.结论 通过计算生物学和基因工程技术相结合的方法构建的骆驼源单域抗体库,针对食品中常见的激素类兽药雌二醇,可以筛选得到背景清晰、具有较高亲和力的特异性抗体.
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细胞内单域抗体的研究及应用进展
来自骆驼或鲨鱼的单域抗体(Single domain antibodies,sdAb)仅包含抗体的重链可变区,而从人抗体中筛选到的人sdAb中包含重链(Heavy chain,VH)或轻链(Light chain,VL)的可变区.与完整抗体和scFv(Single chain antibody fragment)相比,sdAb是体外和体内都稳定的非聚合分子.与scFv片段不同,sdAb是细胞质/细胞核蛋白质的新型抑制剂,并可以在细胞质中正确折叠.sdAb能特异性抑制翻译后修饰,如磷酸化位点,构象异构体或蛋白质的相互作用区域,这些区域不适合使用基因敲除及RNAi技术进行研究.作为细胞质/细胞核蛋白质的抑制剂,使用sdAb的研究数量持续增加,同时使用无需免疫动物的合成单域抗体文库中,研究者筛选出一些有成药应用前景的药物分子.目前,研究涉及的抗原靶点包括病毒蛋白、癌相关蛋白、毒素、神经系统相关蛋白、植物和果蝇蛋白等,可以针对几乎所有的细胞质/细胞核中的抗原表位,进行功能性sdAb的筛选.逃逸蛋白结构和细胞穿透肽的高效转染的研究,拓宽了sdAb的应用领域.新一代细胞特异性纳米颗粒,将携带细胞质/细胞核sdAb作为蛋白抑制剂,开拓病毒感染及癌症新的治疗领域.
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纳米抗体在肿瘤分子显像中的应用
纳米抗体是一种由骆驼源的重链可变区组成的单域抗体,具有相对分子质量小、亲和力高和化学稳定性好等特性,非常适于进行肿瘤以及其他疾病的PET、SPECT显像和辅助治疗研究.纳米抗体在分子影像诊断方面的优势很可能使其成为新一代核医学显像剂.
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抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定
目的 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性.方法 从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH 单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a(+)中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况.结果 VH 单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a(+)中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带.经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白.竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性.结论 成功构建了抗AFP的VH单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础.
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骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究
目的:获得特异识别SpaA-N的单域抗体.方法:用His-SpaA-N重组抗原从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中,筛选SpaA-N的结合子.经测序后亚克隆至pET30a并在E coli BL21高表达,用镍离子亲和层析柱纯化.ELISA分析重组单域抗体的热稳定性,Western blot检测结合特异性.结果:经His-SpaA-N筛选富集后,筛选得到2个目的克隆.构建至pET30a,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符.SDS-PAGE显示,Mr29 000和23 000有特异性目的条带.ELISA检测显示,抗SpaA-N的VHH对SpaA-N重组蛋白具有很好的结合活性；VHH热变性后,经室温复性均可以恢复其抗原结合活性.Western blot显示,重组VHH在Mr66 000处可以识别丹毒丝菌中存在的表面蛋白.结论:获得了具有热稳定性和特异结合SpaA-N的单域抗体,为进一步研究spaA抗原在丹毒丝菌感染免疫中的作用提供了基础.
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抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达
目的 扩增出抗前列腺特异抗原(PSA)单克隆抗体(MAb)的重链可变区(V H)单域抗体基因，并在大肠杆菌中表达. 方法 从分泌抗PSA mAb的杂交瘤细胞系E 4B7中提取总RNA，经RT-PCR扩增VH单域抗体基因，将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达. 结果 VH单域抗体基因全长363 bp，含起始码和终止码.将其克隆 到pGEX-4T-1内，转化大肠杆菌DH5α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的38%，以包涵体形式存在.经初步纯化和复性后，用谷胱甘肽(GST)亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗PSA VH单域抗体. 竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性. 结论 构建成功抗PSA的VH单域抗体，为进一步临床应用奠定基础.
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鼠抗人TNF-α单域抗体基因在大肠杆菌中的融合表达
目的:RT-PCR法获得鼠抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)单克隆抗体E6轻、重链可变区基因序列,分别构建融合表达载体pGE6VH和pGE6VL,利用大肠杆菌系统表达VH和VL单域抗体蛋白. 方法:将RT-PCR法获得的E6VH和E6VL基因分别克隆入融合表达载体pGEX4T-1中,使它们受控于Ptac启动子, 转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,100 g/L SDS-PAGE检测表达产物. 结果:SDS-PAGE显示E6VH表达产物分子质量约为38 ku,E6VL表达产物分子质量约为37 ku,与预期结果相符. 光密度扫描结果表明,谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-VH融合蛋白占菌体总蛋白的45%,GST-VL 融合蛋白占菌体总蛋白的36%,Western-blot证实在相应分子质量处,有GST-VH和GST-VL融合蛋白的显色条带. 结论:在大肠杆菌DH5α中成功地表达了hTNF-α的单域抗体基因.
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抗人γ-精浆蛋白VH单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析
目的构建抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)重链可变区(VH)单域抗体/人p53四价功能域融合基因,并进行空间构象分析.方法选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p53四价功能域之间连接的linker.利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p53四价功能域融合基因,并在融合基因5'端和3'端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点,将融合基因克隆入pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p53克隆载体.将抗人γ-Sm VH单域抗体克隆入pUC19/IgG3/p53载体中,构建抗人γ-Sm VH单域抗体/人p53四价功能域融合基因.经酶切鉴定及序列测定证实后,利用计算机软件进行空间构象分析.结果获得了抗人γ-Sm VH单域抗体/人 p53四价功能域融合基因,基因全长528bp,可编码176个氨基酸,与已发表的抗人γ-Sm VH单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p53四价功能域基因cDNA序列一致.计算机软件分析结果显示,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体,并具有四条长的、柔性好的多肽,可确保每个抗体空间构象的独立性.结论构建成功四价抗人γ-Sm VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础.
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抗人γ-精浆蛋白VH单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析
目的扩增出抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)单克隆抗体(mAb)的重链可变区(VH)单域抗体基因，并进行原核表达及空间构象分析。方法从分泌抗γ-Sm mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，经RT-PCR扩增VH单域抗体基因，将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达，并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果VH单域抗体基因全长363 bp，含起始码和终止码。将其克隆到pGEX-4t-1内，转化大肠杆菌DH5α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的38％，以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后，用谷胱甘肽(GST)亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗γ-SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示，该抗体具有完整的抗原结合位点。结论构建成功抗γ-Sm的VH单域抗体，为进一步临床应用奠定基础。
