首页 > 文献资料
-
基因治疗在传染病防治中的应用研究进展
传染病是目前人类所面临的一类重大疾病,在某些疾病状态下,人类还未寻找到理想的治疗方法,如病毒感染等.现代基因治疗是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、反义核酸类基因药物进行疾病治疗的方法.经过20多年的发展,技术逐步走向成熟,在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景.传染性疾病的基因治疗包括:基因疫苗、RNA干扰、胞内抗体等.
-
抗Cyclin D1胞内抗体AD5N对宫颈癌HeLa细胞的影响
目的:抗Cyclin D1胞内抗体AD5N对宫颈癌细胞增殖的抑制效应分析.方法:将携带抗Cyclin D1胞内抗体AD5N的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,利用脂质体介导法稳定转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性细胞株,进一步通过Westem blot、MTT法及流式细胞术分析该胞内抗体的细胞内表达和抗肿瘤效应.结果:ADSN在稳定筛选的细胞株中有效表达,与空细胞和空质粒转染的细胞株相比,明显抑制HeLa细胞增殖,并诱导细胞凋亡(P＜0.01).细胞周期G0-G1期指数增高10.35%,S期指数下降15.77%,凋亡细胞指数上升6.38%.结论:抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因的表达,抑制宫颈癌细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,并诱导细胞凋亡.
-
抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响
目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响.方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP+的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化.结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP.RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达.与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制.结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础.
-
抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体抑制K562细胞体外生长
目的:观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体基因后,对其体外生长的影响.方法:通过表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的模型:K562-ibE-eGFP细胞,观察该细胞与对照细胞在有血清培养条件下的细胞生长和无血清培养条件下细胞活力,并观察无血清培养24 h细胞形态学变化.结果:与对照组相比,K562-ibE-eGFP细胞在有血清培养条件下生长受抑制,在无血清培养条件下细胞活力显著下降,并且无血清培养24h细胞出现早期凋亡形态变化.结论:通过转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体的方法能抑制慢性粒细胞白血病细胞体外生长,并促进其在无血清条件诱导下凋亡,这可能是细胞内酪氨酸激酶活性降低,BCR/ABL信号途径被阻断,逆转了BCR/ABL对细胞生长和凋亡的影响作用.
-
细胞内单域抗体的研究及应用进展
来自骆驼或鲨鱼的单域抗体(Single domain antibodies,sdAb)仅包含抗体的重链可变区,而从人抗体中筛选到的人sdAb中包含重链(Heavy chain,VH)或轻链(Light chain,VL)的可变区.与完整抗体和scFv(Single chain antibody fragment)相比,sdAb是体外和体内都稳定的非聚合分子.与scFv片段不同,sdAb是细胞质/细胞核蛋白质的新型抑制剂,并可以在细胞质中正确折叠.sdAb能特异性抑制翻译后修饰,如磷酸化位点,构象异构体或蛋白质的相互作用区域,这些区域不适合使用基因敲除及RNAi技术进行研究.作为细胞质/细胞核蛋白质的抑制剂,使用sdAb的研究数量持续增加,同时使用无需免疫动物的合成单域抗体文库中,研究者筛选出一些有成药应用前景的药物分子.目前,研究涉及的抗原靶点包括病毒蛋白、癌相关蛋白、毒素、神经系统相关蛋白、植物和果蝇蛋白等,可以针对几乎所有的细胞质/细胞核中的抗原表位,进行功能性sdAb的筛选.逃逸蛋白结构和细胞穿透肽的高效转染的研究,拓宽了sdAb的应用领域.新一代细胞特异性纳米颗粒,将携带细胞质/细胞核sdAb作为蛋白抑制剂,开拓病毒感染及癌症新的治疗领域.
-
抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用
目的:构建细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体基因的真核表达载体并分析其对乳腺癌细胞增殖的抑制效应.方法:利用PCR技术和分子克隆技术,构建编码细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体基因(AD5N)的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,利用脂质体介导法转染MCF-7细胞,RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot和流式细胞术分析该胞内抗体基因AD5N在MCF-7细胞中的表达、定位及抑瘤效应.结果:经限制性内切酶分析及序列分析发现,成功构建编码细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体(AD5N)基因的真核表达载体pcDNA3.1-AD5N,基因片段为855 bp,编码285个氨基酸,分子量约为30 kD.RT-PCR、免疫荧光及Western blot实验结果显示,仅在转染胞内抗体基因的MCF-7细胞中存在该胞内抗体的表达,并且主要分布在细胞核区域.与野生型MCF-7细胞和转染空质粒的细胞相比,在MCF-7/pcDNA3.1-AD5N细胞中AD5N的表达可明显抑制MCF-7细胞增殖,显著诱导细胞凋亡(P＜0.01),使G0-G1期细胞周期指数增高12.64%,S期指数下降15.22%,凋亡细胞指数上升9.15%.结论:细胞核定位的抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因的表达,可有效抑制乳腺癌细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,并诱导细胞凋亡.
-
纳米抗体应用于感染疾病的研究现状
纳米抗体独特的分子特性使其适用于疾病诊断治疗的许多不同领域.抗病毒、细菌、寄生虫感染以及毒素中和等应用领域的纳米抗体正处于不同的研发阶段.研发中的纳米抗体不仅以病原体表面抗原为靶点,调动宿主免疫系统的补体固定和调理吞噬杀伤来清除病原体,而且中和病原体产生的毒素,显著降低对宿主细胞结构和功能的损害作用,降低感染的严重程度.抗体工程技术突飞猛进的发展,推动了抗感染纳米抗体的探索及尝试.临床试验中的2个抗病毒纳米抗体均处于试验后期阶段,相关结果尚需进一步观察.不断的研究和推进或将使纳米抗体在未来的感染疾病应用中占据一席之地.
-
胞内抗体研究进展及临床应用前景
胞内抗体(intracellular antibody,intrabody)是一类在细胞内表达、特异性地靶向胞内抗原以期实现对相应功能的调节甚至阻断的新型基因工程抗体.常见的胞内抗体形式为单链抗体(ScFv).通过相应定位信号肽序列,胞内抗体能定位于胞浆、胞核、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜和过氧化酶体等各种细胞器,以实现对靶标抗原的功能性调控.其应用也由早先的干扰病毒复制和抑制肿瘤生长,逐渐拓展至治疗中枢神经系统退行性疾病、自身免疫病以及抑制免疫排斥等方面.本文对胞内抗体的作用机制、筛选策略、优缺点、应用及跨膜抗体作一综述.
-
内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤细胞侵袭和增殖的抑制作用
背景与目的:侵袭转移是恶性肿瘤细胞的重要特性,Ⅳ型胶原酶(包括基质金属蛋白酶 2和基质金属蛋白酶 9)在恶性肿瘤转移扩散中发挥着极其重要的作用.我们通过胞内抗体技术,阻断Ⅳ型胶原酶的分泌,以期达到抑制恶性肿瘤细胞侵袭转移的效果.方法:构建编码可在内质网滞留的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达载体 pcDNA3.1 ER.scFv,并转染入人巨细胞肺癌 PG细胞系内. Western blot 检测 pcDNA3.1 ER.scFv的表达,免疫共沉淀实验分析胞内抗体 ER.scFv在 PG细胞内与靶蛋白相互作用情况,明胶酶谱检测Ⅳ型胶原酶的分泌,以及体外侵袭和增殖实验.结果: ER.scFv在 PG细胞内表达,而且能够识别和结合靶蛋白基质金属蛋白酶 9.通过胞内抗体的基因转染,显著抑制了Ⅳ型胶原酶的功能和活性. ER.scFv转染的 PG细胞较野生型和空白质粒组,侵袭能力明显降低,抑制率为 76.3%( P< 0.05),在 Matrigel上进行细胞培养, ER.scFv对 PG细胞有明显的抗增殖效果.结论:内质网滞留型胞内抗体技术可以在蛋白加工、分泌这一关键通路中抑制肿瘤细胞Ⅳ型胶原酶的活性,进而抑制了肿瘤侵袭和增殖,在肿瘤基因治疗中具有应用前景.
-
MG7胞内抗体的表达及活性鉴定
目的制备MG7胞内抗体并鉴定其分子量和抗原结合活性.方法以含MG7 scFv基因的质粒pCANTAB5E为模板,PCR扩增MG7 scFv基因,并在其3'端引入一段内质网滞留序列(SEKDEL),即形成MG7胞内抗体基因.DNA测序后,将MG7胞内抗体基因克隆到表达载体pGEX-3X中,转化宿主菌HB2151,IPTG诱导,SDS-PAGE分析产物分子量,ELISA检测产物的MG7抗原结合活性.结果电泳分析发现融合基因片段长约780 bp.DNA序列分析显示,SEKDEL与MG7 scFv基因正确融合;SDS-PAGE分析发现MG7胞内抗体的分子量为32 000 u;ELISA检测发现MG7胞内抗体具有明显的抗原结合活性.结论我们成功地制备并表达了MG7胞内抗体,为利用其探讨MG7抗原的功能及胃癌的基因治疗奠定了基础.
-
胞内抗体和胞内因子技术与疾病的分子治疗
胞内抗体和胞内因子技术是一种新颖的基因治疗策略,也是用于表型敲除研究的又一有力工具.胞内抗体/因子通过基因重组技术在细胞内表达并被定位于特定的亚细胞器中,能够特异性地结合细胞内靶分子,进而影响靶分子的加工或分泌过程及其生物学效应,已在人艾滋病、恶性肿瘤、移植排斥和神经变性等疾病的分子治疗领域彰显出潜在的应用前景.
-
胞内抗体技术在肿瘤基因治疗中的研究进展
基因治疗是目前恶性肿瘤的研究热点.其中,胞内抗体技术通过黏附、中和、修饰等特异性干扰或阻断肿瘤细胞某些生物分子活性或加工、分泌过程,改变其恶性表型.已逐渐成为研究和治疗肿瘤的重要方法.
-
9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3分 子表达的抑制作用
[欧阳为明，金伯泉，夏海滨，刘 飞，李德敏，张建平. 中华微生物学和免疫学 杂志，2001;21(1):58-61] 目的 获得9.1C3胞内抗体基因的真核表达载体，观察胞内抗体对9.1C3分子表 达的抑制作 用，为进一步研究9.1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础. 方法 设计引 物，以9.1C3 ScF v基因为模板进行PCR扩增，引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标 记的Etag序列. 回收纯化PCR产物，酶切后连接到pUC19载体上，并进行序列测定. 序列正确 后 切下胞内抗体基因片段，重组到真核表达载体pRc/CMV中，酶切鉴定后用DEAE-dextran方法 瞬时转染真核细胞COS7，用胞内染色和Westem blot 方法检测胞内抗体的表达. 接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9.1C3阳性的Jurkat细 胞，用FCM观察胞内抗体对9.1C3分子表达的影响. 结果 DNA序列测定证明 ，通过PCR成功地 为9.1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E-tag序列，成功地构建了胞内抗体 真核表达载体，通过胞内染色方法和Westem blot证明胞内抗体在COS7中得到表达. 转入Jur kat细胞后发现胞内抗体能下调9.1C3分子的表达水平. 结论 以9.1C3 ScF v基因为模板PCR扩增得到9.1C3胞内抗体基因，并构建了真核表达载体.(井晓梅)
