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基于纳米抗体和石墨烯/金复合材料的免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原的研究
将抗日本血吸虫SEA纳米抗体固定于镀金的石墨烯薄膜上,制备一种新型的阻抗型免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原.使用扫描电镜、原子力显微镜和拉曼光谱对石墨烯薄膜及石墨烯/金复合材料进行了表征,并对制备的免疫传感器的特异性和灵敏度进行了测试.结果显示,所制备的免疫传感器具有较好的特异性和灵敏度,与曼氏裂头蚴、刚地弓形虫、颚口线虫、简单异尖线虫、华支睾吸虫和卫氏并殖吸虫抗原没有交叉反应,检测日本血吸虫可溶性虫卵抗原达到0.01 ng/mL水平;血吸虫病患者血清的阳性检出率为66.7%,优于现有试剂盒ELISA法56.7%的检出率,与ELISA的符合率为90%.该免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原具有较高的灵敏度和特异性,制作方法简便、快速等优点,具有较好的应用潜能.
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抗日本血吸虫SEA纳米抗体制备与分析
利用制备的日本血吸虫虫卵抗原(SEA),免疫健康双峰驼Bactrian camel,分离其外周血淋巴细胞提取总RNA,利用RT-PCR扩增骆驼重链抗体IgG可变区(VHH)基因片段,将VHH片段与载体pMECS连接后电转入大肠杆菌TG1构建纳米抗体文库.经亲和筛选、phage-ELISA以及测序分析后,挑取阳性克隆,抽提质粒,电转入大肠杆菌WK6诱导表达纳米抗体.通过间接ELISA分析纳米抗体VHH-1的敏感性和特异性.结果显示,纳米抗体文库容量为2.3 ×108,测序分析显示,所获得的纳米抗体文库具有良好的多态性.经NI-NTA和AKTA纯化后获得高纯度纳米抗体.ELISA分析表明所获得的纳米抗体VHH-1具有较好的敏感性和特异性.为进一步开展纳米抗体在日本血吸虫诊治研究中的应用奠定一定基础.
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基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析技术的初步研究
为建立基于纳米抗体的检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析技术,将已经通过噬菌体文库筛选得到的两株纳米抗体的质粒,在枯草芽孢杆菌中表达,得到具有活性的抗体蛋白 (VHH-48、VHH-52) 并以NI-NTA亲合层析纯化.以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,标记VHH-48和VHH-52抗体蛋白并制备金标垫,分别用日本血吸虫可溶性虫卵抗原 (SEA) 和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,确定抗体蛋白的佳标记pH和适蛋白浓度.采用抗体双夹心的方法对两株抗体蛋白进行组合,建立胶体金免疫层析方法.以优化的双夹心抗体组合,组装试纸条,进行了灵敏度的测定和血吸虫病人粪检阳性血清的敏感性评估,以并殖吸虫等其他寄生虫感染的血清测定了试纸条的特异性.结果显示,成功表达并获得了纯度较高的纳米抗体.胶体金标记VHH-48和VHH-52抗体的适蛋白量为14和10 μg/mL,适pH分别需要加入16和12 μL体积的0.2 mol/L K2CO3,并确定以VHH-52标金和VHH52划线为佳的抗体双夹心组合.对可溶性虫卵抗原的低检测量为3.4 ng/mL,检测血吸虫病人阳性血清的检出率为2.27%,检测其他寄生虫感染血清结果显示出良好的特异性.本文构建了基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析试纸条方法,为纳米抗体在血吸虫病快速诊断的应用奠定了一定基础.
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抗人Her2抗原羊驼纳米抗体的筛选与鉴定
目的 获得靶向人Her2纳米抗体.方法 使用重组人Her2蛋白免疫羊驼,分离免疫后羊驼的淋巴细胞提取总RNA,利用PCR技术扩增羊驼IgG的可变区(VHH)基因片段,构建噬菌体表面展示的纳米抗体文库,采用Her2抗原对文库进行亲和筛选,将筛选到的克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG 诱导表达重组蛋白,镍离子亲和层析柱纯化获得纳米抗体并用ELISA技术和Biacore检测其与抗原Her2的亲和力,采用免疫组化方法检测Her2阳性乳腺癌组织中Her2的表达.结果 第二轮筛选后得到2个抗体H3和H5,ELISA结果显示两者都具有抗原结合活性,其中H5的亲和力达8.106×10-10 mol/L.H5可识别乳腺癌组织中Her2抗原的表达.结论 从Her2免疫的羊驼体内,通过噬菌体展示技术筛选获得了1个具有较高抗原结合活性的抗Her2纳米抗体,可用于乳腺癌的病理诊断.
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抗人CD147纳米抗体的筛选与鉴定
目的 获得靶向人CD147的纳米抗体.方法 以胞外区全长CD147蛋白为靶标,从噬菌体展示文库中筛选CD147的纳米抗体,将筛选获得的单域抗体可变区(VHH)目的基因克隆至pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纳米抗体,使用AKTA start+GE Ni-NTA预装柱对带有组氨酸(His)标签的重组蛋白进行纯化并用酶联免疫吸附实验、生物膜层干涉技术、蛋白质免疫印迹法及激光共聚焦显微镜成像技术检测纳米抗体的特异性和亲和力.结果 经过3轮筛选获得了1个特异性结合CD147抗原的纳米抗体12-3,其亲和力达到9.46×10-9 mol/L,且可特异性地识别肿瘤细胞表面的CD147抗原.结论 从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中筛选获得了1个高亲和力抗CD147的纳米抗体,有望用于肿瘤诊断.
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TIM-3纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗的一个重要突破口.T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3 (T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3,TIM-3)作为T细胞抑制性免疫检查点,在肿瘤抗体治疗中具有独特的应用优势.骆驼科动物体内存在的一种天然缺失轻链的纳米抗体(nanobody,Nb),逐渐成为新一代抗体治疗的新兴力量.本研究利用TIM-3抗原成功免疫新疆双峰驼,建立噬菌体展示文库,并通过噬菌体展示技术初步筛选出29株序列差异的TIM-3纳米抗体.另外,本研究成功构建了TIM-3稳转细胞株,利用流式细胞仪从这29株纳米抗体中筛选出10株特异性强且亲和力高的TIM-3纳米抗体.本研究将为功能性阻断型TIM-3纳米抗体的后续筛选和TIM-3全人源纳米抗体创新药物的开发奠定基础.
关键词： T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3 纳米抗体 噬菌体展示库 -
抗程序性死亡受体-1纳米抗体的制备及鉴定
目的 制备能与程序性死亡受体-1(PD-1)抗原高亲和力结合的骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供实验基础.方法 采用真核表达的PD-1-Fc重组蛋白对新疆双峰驼进行6次免疫,采集其外周血并从中分离得到淋巴细胞,进行巢式PCR扩增获取骆驼重链抗体可变区(VHH)基因,并构建噬菌体展示文库.然后采用固相酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选噬菌体展示文库,包被质量浓度依次降低(5.00、2.50、1.00 μg/ml)的PD-1抗原于ELISA板中,对噬菌体展示文库进行3轮亲和淘选.接着采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选与PD-1结合的单个克隆.根据DNA测序结果挑选具有多次重复序列的3个VHH单克隆构建至pET22b载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达.后采用镍柱亲和层析纯化重组VHH抗体蛋白,蛋白质印迹法(Western Blot)和ELISA法检测其与PD-1抗原的结合活性和亲和力.结果 采用重组蛋白PD-1-Fc对双峰驼免疫6次后,激发了高滴度的特异抗体,免疫血清效价达到1∶32 000.从免疫后的骆驼淋巴细胞构建了库容大小为2.6× 108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库.经3轮亲和筛选后,采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选获得46个吸光度(A600)值在0.6以上的单个VHH克隆.其中VHH-B7、VHH-H5和VHH-H12三个克隆序列具有较高重复,表明获得了显著富集.Western Blot及ELISA法检测结果显示,纯化的B7、H5和H12纳米抗体均与PD-1抗原具有较好的结合活性,且具有较高的亲和力,亲和力常数分别为1.19×1011、1.63×1011、1.59×1011 L/mol.结论 通过对VHH噬菌体展示文库进行亲和筛选,获得了能与PD-1抗原高亲和力结合的抗PD-1骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供了实验基础.
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骆驼纳米抗体随机突变噬菌体展示文库的构建与质量分析
目的 构建人工突变的噬菌体展示文库并与天然噬菌体展示文库序列对比,进而对人工突变的噬菌体展示文库的质量进行科学评价,为纳米抗体的进一步改造提供鉴.方法 对结合人卵泡刺激素受体(FSHR)的纳米抗体的抗原互补决定区3(CDR3)进行NNY定点饱和突变,合成VHH06-ΔCDR3随机突变DNA.将突变DNA序列连接到载体pMECS上,构建VHH06-ΔCDR3突变噬菌体展示文库.通过DNA测序和分析,比较该文库与FSHR免疫的VHH噬菌体展示文库的多样性和CDR3区的氨基酸分布.采用FSHR对文库进行6轮亲和筛选,测定筛选后克隆的富集程度.结果 按照NNY突变原则,合成了长度为16个氨基酸的CDR3随机突变基因库.成功构建了库容量为7.36×108 cfu/ml的VHH06-CDR3随机突变噬菌体展示文库.多克隆与单克隆phage酶联免疫吸附实验结果显示,经过6轮筛选,输出噬菌体与FSHR的结合明显得到富集,但获得的克隆与FSHR没有明显结合.结论 VHH06-ΔCDR3随机突变噬菌体展示文库尽管具有序列多样性,但由于CDR3缺乏功能多样性,导致其在亲和筛选中不利于获得目标抗体.
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HER2的表达及其分子影像的研究进展
人表皮生长因子受体2(HER2)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体,同时也是一种高表达于各种癌细胞的生物标志物.高表达HER2的肿瘤往往预后不良.HER2分子影像主要是利用放射性核素、磁性材料、发光物质等标记配体能与HER2特异性结合的特性,对患者体内HER2高表达病灶进行显像,从而协助HER2阳性疾病的诊断,筛选出抗HER2治疗有效的患者,并可用于疗效评估,是近年来肿瘤精准医疗研究的热点之一.
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纳米抗体应用于肿瘤治疗的研究现状
纳米抗体(nanobodies,Nbs)具有较小的相对分子质量,其独特的分子结构使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域,由于其缺少Fc段,不能引发普通单抗药物在肿瘤治疗中重要的细胞毒作用,在肿瘤治疗领域的前景一度不被看好,但随着药物研究的不断深入及更合理的设计,Nbs在该领域的应用正在不断扩展.目前研发中的Nbs是以直接拮抗作用、与效应分子相连、与药物递送系统相连等多种形式参与肿瘤治疗,并可联合应用于靶向性放射核素疗法及光动力疗法中.本文就Nbs的成药特性、Nbs在肿瘤治疗中的应用及目前处于临床试验阶段Nbs药物的研究现状作一综述.
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纳米抗体应用于感染疾病的研究现状
纳米抗体独特的分子特性使其适用于疾病诊断治疗的许多不同领域.抗病毒、细菌、寄生虫感染以及毒素中和等应用领域的纳米抗体正处于不同的研发阶段.研发中的纳米抗体不仅以病原体表面抗原为靶点,调动宿主免疫系统的补体固定和调理吞噬杀伤来清除病原体,而且中和病原体产生的毒素,显著降低对宿主细胞结构和功能的损害作用,降低感染的严重程度.抗体工程技术突飞猛进的发展,推动了抗感染纳米抗体的探索及尝试.临床试验中的2个抗病毒纳米抗体均处于试验后期阶段,相关结果尚需进一步观察.不断的研究和推进或将使纳米抗体在未来的感染疾病应用中占据一席之地.
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纳米抗体：一种新型的分子成像工具
纳米抗体(nanobody, Nb)是存在于骆驼科血液中的一种天然缺失轻链的重链抗体。以纳米抗体为基础的分子探针和放射性核素，近红外染料，超声微泡等相结合，被应用到多种疾病的分子成像。该文结合近几年纳米抗体在分子成像中的应用和临床数据，来介绍它作为一种新型的分子成像工具在疾病诊断中的应用及未来发展方向。
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双-多特异性纳米抗体的构建形式
双特异性抗体(双抗)可以同时特异性结合2种不同抗原,已成为抗体工程领域研究的热点.这些研究主要集中在癌症治疗方面,虽疗效显著但还未达到临床佳状态.由于双抗有2条重链和2条轻链,因而极易出现错配.为解决这一问题,研究者设计出许多不同的双抗形式,例如串联单链抗体、双可变结构域抗体或使用“knobs-into-holes”方式构建的抗体,但仍不能得到优的双抗.纳米抗体是目前已知小的全功能抗体,具有许多优异的理化特性,为构建双-多特异性抗体提供了一种全新的途径.
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纳米抗体的研究进展
单克隆抗体已用于疾病的诊断与治疗,但因其体积大、稳定性较差等固有缺点,其应用受到一定限制.而Nb具有体积小、抗原结合性能好、组织穿透力强、稳定性高等卓越性能,在疾病诊断、治疗等临床应用方面有广阔的发展前景.
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基因工程抗体片段——谱写抗体家族的新乐章
随着分子生物学技术的进步和机体基因结构的阐明,以小分子抗体为基础并经基因工程改建从而用于研究和临床诊治的大量基因工程抗体片段应运而生.其中,可将生物学活性效应桥连于治疗靶标的双特异性抗体、同时增强抗体效能及细胞毒靶向性的免疫结合物、以独特的单域结构在生物技术和临床医学等方面倍受青眯的纳米抗体,以及在细胞内特定部位表达的细胞内抗体是近年来研究活跃的几个领域凭借免疫原性弱、组织渗透性强、低毒性及制备简便等优势,基因工程抗体片段较之单克隆抗体受到了更广泛的关注与认可.尽管大多数处于临床开发的抗体片段的安全性和有效性还有待确定,但基因工程抗体片段的研发必将大大提高人类疾病尤其是肿溜的诊治水平.
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Her2纳米抗体与改构内皮抑素融合蛋白的克隆、表达和活性研究
开发一种靶向于乳腺癌的双功能蛋白,探索其对乳腺癌细胞的抑制效果和靶向性.通过分子生物学手段构建融合蛋白的原核表达质粒,并对其进行大量表达,包涵体变复性方法获取可溶性目的蛋白.通过CCK8实验检测可溶性目的蛋白对乳腺癌生长的抑制效果,通过细胞免疫荧光实验检测可溶性目的蛋白的靶向特异性和细胞内化作用.使用重叠PCR定点突变技术成功构建出改造型内皮抑素基因endo(m),而后通过限制性酶切法将其连接到原核表达质粒pET28a-Dim上,成功构建出融合表达质粒pET28a-Dim-endo(m).融合蛋白Dim-endo(m)是以包涵体形式被表达,选用包涵体变复性方法获取大量可溶性目的蛋白.细胞免疫荧光检测发现融合蛋白可以结合到乳腺癌Her2表达阳性的SKBR3细胞,同时也能抑制该肿瘤细胞的增殖.pET28a-Dim-endo(m)成功构建并表达,融合蛋白能和乳腺癌细胞Her2受体结合,并在穿膜肽的作用下进入细胞,同时具有一定的抑制肿瘤细胞增殖的作用,可用于后续研究和进一步开发相应的乳腺癌检测试剂.
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骆驼来源的纳米抗体人源化研究进展
纳米抗体作为一种小分子抗体,与传统抗体以及衍生出的单链抗体(ScFv)相比,具有高亲和力、高特异性以及高稳定性等特点.同时它还具有传统抗体不具备的优势,分子质量小,体内组织渗透性好,极易穿过血管或组织到达靶部位,这些优势使得纳米抗体被广泛的用于疾病诊断与检测的工具.迄今为止,已有多种多价的纳米抗体进入各期临床研究,应用于癌症、自身免疫病、呼吸系统、血液系统等疾病.并随着研究的不断深入会有更多的纳米抗体应用于临床,但是多价的纳米抗体如果长期用于临床可能会产生不同程度的免疫反应,影响治疗效果,因此,纳米抗体进行人源化越来越被关注.该文介绍几种纳米抗体人源化策略及表达系统.
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新型小分子纳米抗体药物与靶向治疗的研究进展
基因工程抗体研究通过抗体结构改造、抗体作用新靶点以及新型小分子抗体药物研发等方法,使抗体药物逐渐趋于人源化、小型化、高效化,已在临床诊断、治疗等方面碍到广泛应用,是肿瘤靶向治疗的重要手段.故着重介绍一种小型化基因工程抗体——纳米抗体.纳米抗体由于其技术的先进性和独特性,与普通抗体药物相比,具有相对分子质量小、易于表达、在血液中半衰期相对较短、穿透力强、免疫原性弱等特点,在抗肿瘤、抗病毒等领域具有广阔前景.
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Nanobody在分子影像诊断和分子靶向治疗研究中的应用进展
1 Nanobody的定义及特性
纳米抗体(Nanobody,Nbs),即重链单域抗体VHH (variable domain of heavy-chain antibod-y)--骆驼体内存在的天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody,HCAb),克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体,是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的小单元。由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低等特点,成为当前分子影像研究中的重要靶分子,具有广阔的应用前景。 -
抗体技术研究进展(2):小分子抗体及功能复合化抗体
随着分子生物学的发展,基因工程小分子抗体以及纳米抗体由于其分子质量小、结构简单、异源性低、组织穿透能力强及易于大量生产等优点而越来越受到人们的关注,并且其与毒素、酶、细胞因子等生物活性物质融合可产生功能复合化抗体——抗体融合蛋白,在肿瘤的诊断和治疗中具有广阔的应用前景.本研究主要就小分子抗体、功能复合化抗体以及纳米抗体近几年的发展与应用进行综述.
