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细胞因子模拟肽/非肽刺激造血的研究进展
能刺激造血的细胞因子如红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)等通过与其受体的特异性结合来调控造血细胞的自我更新、增殖、分化、成熟及程序性死亡.近年来利用噬菌体展示文库等技术业已筛选出类似于细胞因子活性的模拟肽类和非肽类小分子,经体外和动物试验证实它们具有类似于细胞因子的刺激造血生物学功能.这为进一步探讨细胞因子的作用机制、筛选出理想的模拟其它细胞因子功能的小分子肽/非肽类药物奠定了坚实基础.本文概述了模拟红细胞生成素和血小板生成素等细胞因子的肽类/非肽类小分子的作用机理、生物活性及在受体活化研究领域的新进展和应用前景.
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靶向乙型肝炎病毒HBP-TP蛋白的多肽筛选与鉴定
目的 筛选与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶TP区(HBP-TP)相互结合的特异性多肽并研究其对HBV复制水平的影响.方法 以大肠杆菌原核表达的HBP-TP重组蛋白为底物,对噬菌体多肽展示文库进行筛选获得特异性噬菌体并测序其多肽区.统计重复率大于10％的多肽序列进行商品化合成.将合成多肽作为药物处理HBV表达细胞后检测HBV复制水平的变化.结果 从噬菌体多肽展示文库中筛选出8条靶向HBP-TP重组蛋白的多肽,在细胞水平的检测中发现其中有1条多肽对HBV的复制有明显的抑制作用.结论 获得1条对HBV复制水平具有抑制作用的靶向HBP-TP蛋白特异性多肽.
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HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选
目的探讨噬菌体随机肽展示技术在筛选和鉴定病毒抗原序列研究中的应用前景。方法用噬菌粒展示载体pCANTAB5X，构建HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库。用抗-HCV核心单独阳性的血清对该库进行4轮筛选，获得多个阳性克隆，测定和分析8个杂交阳性克隆的DNA序列。结果构建的随机文库含1.23×105个不同克隆，噬菌体滴度为2×1012TU/ml（转化单位/ml）。所测定的7个阳性序列中的6个为HCV核心蛋白序列，这些序列均含有与免疫筛选结果相似的HCV核心抗原序列。另一个为大肠杆菌nrfa基因。结论所建的噬菌体文库有足够大的库容和较好的随机性，可以从该文库中筛选出正确的HCV C抗原序列。噬菌体展示技术完全可应用于病毒蛋白抗原序列的筛选，并具有简便、快速、准确的优点。
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骆驼纳米抗体随机突变噬菌体展示文库的构建与质量分析
目的 构建人工突变的噬菌体展示文库并与天然噬菌体展示文库序列对比,进而对人工突变的噬菌体展示文库的质量进行科学评价,为纳米抗体的进一步改造提供鉴.方法 对结合人卵泡刺激素受体(FSHR)的纳米抗体的抗原互补决定区3(CDR3)进行NNY定点饱和突变,合成VHH06-ΔCDR3随机突变DNA.将突变DNA序列连接到载体pMECS上,构建VHH06-ΔCDR3突变噬菌体展示文库.通过DNA测序和分析,比较该文库与FSHR免疫的VHH噬菌体展示文库的多样性和CDR3区的氨基酸分布.采用FSHR对文库进行6轮亲和筛选,测定筛选后克隆的富集程度.结果 按照NNY突变原则,合成了长度为16个氨基酸的CDR3随机突变基因库.成功构建了库容量为7.36×108 cfu/ml的VHH06-CDR3随机突变噬菌体展示文库.多克隆与单克隆phage酶联免疫吸附实验结果显示,经过6轮筛选,输出噬菌体与FSHR的结合明显得到富集,但获得的克隆与FSHR没有明显结合.结论 VHH06-ΔCDR3随机突变噬菌体展示文库尽管具有序列多样性,但由于CDR3缺乏功能多样性,导致其在亲和筛选中不利于获得目标抗体.
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噬菌体文库与计算机模拟筛选H1N1流感病毒血凝素结合位点的比较
目的:对H1N1流感病毒血凝素HA的抗原表位初步筛选.方法:用噬菌体展示文库对2株抗体的结合位点进行筛选,将筛选的抗原位点结合HA序列进行多肽合成,免疫小鼠制备单克隆抗体,通过分子生物学手段对4株抗体的轻链和重链可变区基因进行调取,通过计算机模拟抗体序列结合的抗原的结构域,推测抗体结合的氨基酸位点.结果:噬菌体文库筛选得出抗体的结合序列富含组氨酸和精氨酸,将针对多肽的单克隆抗体的序列和前期获得的2株抗HA单克隆抗体的序列比对分析,发现A1-8和anti-14p结合的HA抗原序列相一致,H1-13和anti-11p结合的HA抗原序列相一致.结论:通过将噬菌体展示文库技术和计算机模拟预测抗原抗体结合,可以有效筛选抗原表位,为流感病毒HA抗原表位预测方法的完善提供理论基础.
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抗犬瘟热病毒噬菌体抗体库的构建
目的 构建抗犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)T7噬菌体单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库.方法 用灭活CDV经皮下注射免疫犬,共3次,每次间隔2周,第3次免疫后2周采集犬外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,RT-PCR分别扩增犬IgG重链(heavy chain,VH)和轻链(light chain,VL)基因片段,通过SOE-PCR法将VH和VL用一段linker连接组装成scFv基因,经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切后,连接到表达载体T7 Select 10-3b上,用包装蛋白包装后,以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌进行增殖,随机挑取50个噬菌斑,进行PCR鉴定,并测定文库滴度.结果 扩增的VH和VL基因大小均与预期相符,测序结果经blast比对,扩增的片段与犬IgG的VH和VL序列匹配率达90％以上；所构建的原始文库滴度为3.2×107 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5.0×108 pfu/ml.对随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为94％.结论 成功构建了抗CDV的T7噬菌体抗体库,为犬科动物犬瘟热的防治提供了参考.
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全细胞差减筛选法在噬菌体展示文库筛选中的应用
全细胞差减筛选法是近年来在细胞筛选的基础上发展起来的一项筛选技术,其利用成对的细胞,即两种不同状态的细胞对噬菌体展示文库进行差减筛选,主要用于筛选新的抗原表位、受体、配体、新型疫苗、肿瘤细胞的靶向活性肽、靶向基因载体及受体或酶的激动剂或抑制剂等.本文就其筛选的原理、优缺点、优化及其在噬菌体展示文库筛选中的应用作一综述.
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体内筛选展示脑血管内皮选择性定位多肽的噬菌体
目的:通过噬菌体展示技术寻找能够定位于脑部血管内皮的多肽.方法:通过鼠尾静脉注射展示文库,将脑组织中得到的噬菌体体外扩增,重新注入于Balb/c小鼠.如此3轮筛选,测定所获噬菌体的核苷酸顺序及导出展示多肽的氨基酸顺序,并进行免疫组化分析.结果:得到了展示6个多肽序列的噬菌体克隆.展示3个多肽顺序的噬菌体在脑组织中有明显分布,它们是CSKTAEHTC,QLADTTHHRPWP和SWASLPVGMNSW.免疫组化分析显示展示CSKTAEHTC和QLADTTHHRPWP序列的噬菌体在脑部有明显的阳性分布.结论:展示QLADT-THHRPWP的噬菌体可能对脑血管内皮有更好的结合能力.
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HIV-1 Gag蛋白 P2/NC 蛋白酶切割位点序列的随机化及噬菌体展示
目的:构建HIV-1 Gag PR蛋白P2/NC切割位点序列随机化的噬菌体展示文库,研究HIV-1蛋白酶(protease PR)耐药性突变对其敏感切割序列的影响.方法:PCR扩增制备重组HIV-1 gag基因上的CAP2和NC片段,在CAP2片段5′端引入StuⅠ酶切位点,3′端PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化;在NC片段5′端设计重叠区域,3′端引入SalⅠ酶切位点.应用Overlapping PCR将CAP2和NC片段拼接并克隆于噬菌体展示载体LD3-pCANTAB5S上,建立HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之间切割位点随机化的噬菌体展示文库.结果:该噬菌体展示文库库容量为2.1×106,滴度为3.0×1012TU/ml,CAP2/NC片段插入率为52.1%;12个样品的序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布; 10个阳性单克隆噬菌体CAP2/NC-LD3-pCANTAB5S样品中9个与IgG特异结合.结论:成功地对HIV-1PR靶蛋白CAP2和NC之间切割位点进行了随机化并展示于噬菌体表面,构建了其噬菌体展示文库,为筛选耐药性突变的PR敏感切割序列及构建蛋白酶抑制剂噬菌体筛选模型打下基础.
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噬菌体展示技术筛选日本血吸虫抱雌沟蛋白分子受体
目的 筛选日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用分子.方法 利用噬菌体展示技术,以融合表达的抱雌沟蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法筛选日本血吸虫44 d成虫噬菌体展示cDNA文库.结果 得到70条有效表达序列标签,对其进行聚类分析、同源性搜索与功能预测等生物信息学分析,获得5个与血吸虫抱雌沟蛋白有相互作用的蛋白或多肽.结论 采用筛选噬菌体展示文库的方法成功获得抱雌沟蛋白相互作用分子.
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抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库的构建
目的构建抗人B细胞淋巴瘤单链抗体(ScFv)库.方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增重、轻链可变区基因片断,连接成ScFv基因并扩增,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建成单链噬菌体抗体库.结果抗体库容量为3.4×106,约100%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入.结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体.
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噬菌体展示耐药突变HIV-1蛋白酶敏感切割位点六肽随机文库的构建
目的 构建耐药性突变HIV-1蛋白酶(protease PR)敏感切割位点序列体外噬菌体筛选模型,研究HIV-1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系.方法 用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HIV-1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化,再将重组CAP2片段和NC片段拼接克隆于噬菌体展示载体LD3-pCANTAB5S上,建立HIV-1蛋白酶靶蛋白切割位点随机化的噬菌体展示文库.结果 该噬菌体展示文库库容量为2.6×106,滴度为4.1×1015TU·L-1 ,CAP2片段插入率为47.8%;序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布.结论 成功地构建HIV-1蛋白酶的敏感切割序列噬菌体筛选文库,为筛选到突变PR敏感切割序列噬菌体及研究耐药HIV-1蛋白酶抑制剂与突变PR的关系打下基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒-1 蛋白酶 耐药突变 噬菌体展示文库 -
SPA单结构域突变体组合噬菌体文库的构建及体外进化筛选
目的 使用人免疫球蛋白G( IgG)对金黄色葡萄球菌蛋白A( SPA)单结构域突变体组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同突变体组合的特异结合优势,探索优势组合分子结构与功能间的关系. 方法 通过 Overlap PCR获得SPA中A和C单结构域突变体片段组合构成的噬菌体文库,再使用人IgG对文库进行体外亲和筛选,期望通过对特定结合分子的定向改造及体外进化获得具有高结合优势的组合分子. 结果 成功构建符合体外筛选要求的SPA单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库( A1 )、SPA单结构域C在36、37位定点突变文库( C1 )和SPA单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽( AI37 )、SPA单结构域C在20位后插入3个随机连接肽( CI20 ) ,将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1,将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37 CI20. 两个文库各自经过4、5轮亲和筛选,文库进化完全.Phage-ELISA高光密度值的单克隆,测序结果分析为A(Q29K30) A(I29I30)和AI-TQS A. 结论 通过定向改造技术获得了高结合能力的定点突变分子A(Q29K30) A(I29I30)和插入突变分子AI37-TQS A,为Ig结合分子的定向改造及具有新的Ig结合特性的重组Ig结合分子的进一步研究奠定了基础.
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抗人CTGF单链抗体噬菌体展示文库的构建
目的 构建抗人结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(scFv)噬菌体展示文库.方法 用重组人CTGF(rhCTGF)免疫balb/c小鼠,表达CTGF抗体后取小鼠脾脏获得B细胞,提取总RNA后反转录为cDNA,聚合酶链反应(PCR)获取重链可变区(vh)和轻链可变区(vl),vh和vl再次PCR装配为vl-linker-vh即scFv基因片段,并与噬菌粒PAK100酶连接,形成含有抗结缔组织生长因子单链抗体基因的目的噬菌粒；电转化入大肠杆菌XLl-blue,加入辅助噬菌体扩增后,建立噬菌体展示库重组库.结果 经过凝胶电泳及噬菌粒基因测序分析,证实成功构建了抗结缔组织生长因子单链抗体定向免疫库.结论 成功的构建了抗结缔组织生长因子单链抗体库,为制备抗结缔组织生长因子单链抗体奠定基础.
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利用噬菌体表面展示技术构建人肝癌细胞的cDNA表达文库
目的:筛选对人肝再生增强因子(hALR)高反应性的肝癌细胞株,以此作为细胞来源,利用噬菌体展示技术构建出含有其cDNA表达文库,为进一步从文库中筛选hALR相互作用蛋白奠定基础.方法:hALR刺激不同肝癌细胞株,从中筛选出对hALR刺激有高反应性的细胞株.以Poly ATtract System1000提取mRNA,用T7Select10-3 Orient Express cDNA CloningSystem和Random Primer构建它的cDNA噬菌体表面展示文库;以噬菌体滴度分析和PCR评价文库质量.结果:hALR对不同肝癌细胞株均有不同程度的促增殖作用,且呈明显的剂量依赖关系.对QGY促增殖作用强,以它作为建库细胞.对所建文库进行噬菌体滴度分析,表明原始cDNA文库含有2×107独立的重组子;随机挑取重组子进行PCR鉴定,发现插入长度在0.2～2kb,平均为0.6kb,能够较好地代表来源细胞中mRNA所表达的几乎所有信息.结论:hALR对所检测的肝癌细胞株均有促增殖作用;QGY细胞对hALR刺激有高的反应性;以它为基础,构建出库容量为2×107的高质量噬菌体表面展示文库.
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靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选
目的：构建 V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体，以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用 Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫，分离血液中的淋巴细胞，利用噬菌体展示技术，构建噬菌体展示文库，经过连续3次生物淘筛获得与 Vsig4蛋白结合的噬菌体，经测序和基因比对所得 VHH 序列，用 ELISA法筛选出抗 Vsig4的高亲和力纳米抗体，并用 Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库，经过克隆筛选获得136个 Vsig4阳性单克隆，经测序获得15个不同的VHH 基因，将这些基因克隆至原核表达体系，表达和纯化后获得了高纯度的 Vsig4纳米抗体，其中 Nb119的亲和力高，并且可以与 Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的 Vsig4纳米抗体，以期用于检测巨噬细胞表面 Vsig4的表达和构建特异性分子探针。
