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外源性肝再生增强因子重组质粒在大鼠肝组织中的表达研究
目的 研究外源性肝再生增强因子(ALR)重组质粒在免疫性肝纤维化大鼠肝组织中的表达情况.方法 猪血清腹腔注射制备免疫性肝纤维化大鼠模型,pcDNA3-ALR重组质粒静脉注射对其进行干预,通过免疫组化、Western bolting检测大鼠肝组织ALR蛋白质的表达情况,通过RT-PCR检测ALR mRNA的表达情况.结果 所有组的大鼠肝组织均有ALR蛋白的表达,其中,以正常组表达弱,ALR处理组表达强.图像分析细胞染色密度,正常对照组与模型组的结果分别为(0.109±0.01)和(0.159±0.02),二者相比差异有显著性(P＜0.01);ALR处理组为(0.198±0.04),与模型组相比差异也有显著性(P＜0.01).Western bloting测定肝组织ALR的表达的结果与免疫组化相似.ALR mRNA在各组大鼠肝组织的表达:pcDNA3-ALR处理组在约550bp处出现了用特定引物扩增的特异基因条带,此条带与直接从大肠杆菌中制备的pcDNA3-ALR重组质粒的扩增条带相同.正常对照组和模型组未出现用特定引物扩增的条带.结论 ALR在正常大鼠肝组织的表达较低,在免疫损伤后的肝组织的表达明显增强.ALR重组质粒可在免疫性肝纤维化大鼠肝组织中发生表达,pcDNA3-ALR重组质粒处理组ALR蛋白表达明显增强是由于外源性ALR与内源性ALR表达"叠加"的结果.
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三甲散对实验性肝纤维化大鼠TGF-β及ALR的影响
目的:观察三甲散对实验性肝纤维化大鼠转化生长因子(TGF-β)、肝再生增强因子(ALR)的影响,从分子生物学角度探讨其作用机制.方法:SD大鼠100只,50%CCl4植物油溶液ip造模后分为模型组、马洛替酯组(0.1 g·kg-1)及三甲散低、中、高(0.45,0.9,1.8 g·kg-1)剂量组,并设空白组作为对照.给药8周,测定各组大鼠的转氨酶、羟脯氨酸(Hyp)及血清透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、三型前胶原(PⅢNP)、四型胶原(PⅣP),肝组织TGF-β,ALR的含量;肝组织做病理形态学检查.结果:模型组大鼠转氨酶升高,血清HA,LN,PⅢNP,PⅣP升高,肝组织TGF-β,ALR急剧升高,与空白对照组比较,差异非常显著(P＜0.01),病理显示模型组大鼠汇管区及小叶间大量纤维增生.三甲散各剂量组均可降低转氨酶及血清HA,LN,PⅢNP,PⅣP,肝组织TGF-β,ALR含量下降,与模型组比较,差异显著(P＜0.05).结论:三甲散可降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β,ALR的含量,抑制纤维结缔组织的增生.
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肝再生增强因子及其基因家族的研究进展
肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是新发现的一个重要的肝营养性因子,具有独特的分子结构、复杂的生物学功能和作用机制,能够特异性地促进肝细胞再生,在肝脏发育、再生和损伤修复的调节中具有重要作用.其基因家族成员在从低级到高级真核细胞中均有着重要的生物学功能.本文就近年来对ALR及其基因家族的分子生物学特征,以及ALR蛋白的生物学功能和作用机制等方面的研究进展作一综述.
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肝再生增强因子研究进展
肝再生增强因子是新近克隆的蛋白质因子，能特异地刺激肝源细胞的 增殖，并对CCl4所引起的急性肝衰竭有救治作用。本文综述了肝再生增强因子的发现、基 因克隆及组织分布等。目前已开始了该因子的基因工程产品研制，它有望成为一种治疗肝病 的 新药。
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肝再生增强因子研究进展
肝再生增强因子是一种新型的肝细胞刺激因子.本文从分子生物学特性、生物活性与作用机制等方面对肝再生增强因子的研究进展进行综述.
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肝再生增强因子研究进展
肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)又名肝刺激物质或肝细胞生成素,广泛表达于全身各组织器官,尤其是在肝细胞中.近年来不断有研究证实,ALR具有强大的促进肝脏再生和受损肝脏细胞增殖的功能,在肝细胞移植、重型肝炎的发病、肝脏的再生和肝癌发生发展中发挥重要作用.
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重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的增殖活性研究
目的：研究重组人肝再生增强因子（hALR）转染肝细胞系的生物学活性，为生物人工肝细胞反应器提供合适的细胞材料。方法本研究采用转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞，经G418筛选，在体外培养、传代后，进行Western blot免疫印迹实验及免疫荧光实验，检测细胞中hALR的表达，并与未转染重组质粒的HepG2细胞进行比较；采用ELISA方法，检测两组细胞培养液中hALR的分泌情况；使用流式细胞仪检测细胞中增殖细胞相关核抗原Ki-67，了解重组质粒转染前后HepG2细胞的增殖状况。结果转染重组质粒pcDNA3.1(-)hALR的HepG2细胞功能稳定，形态良好，细胞表达及分泌hALR较未转染重组质粒的HepG2细胞多，且随着培养时间的延长，细胞培养液中的hALR含量迅速升高，优于未转染重组质粒的HepG2细胞；转染重组质粒的HepG2细胞中Ki-67阳性细胞计数显著高于未转染重组质粒的HepG2细胞，说明转染重组质粒使肝细胞增殖活跃。结论本研究结果表明，前期研究构建的转染了hALR基因的肝细胞系能较高表达hALR，且细胞增殖活跃。
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Keap1-Nrf2- ARE 和 p53/p21信号通路在对乙酰氨基酚引起肝损伤后肝再生中的作用
对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）过量使用是引起肝损伤的主要原因。代偿性肝再生是药物性肝损伤的关键因素。但是 APAP 引起的肝损伤后肝再生的分子机制尚不清楚。本文旨在讨论 Keap1-Nrf2-ARE 和 p53/ p21信号通路在 APAP 引起肝损伤后肝再生中的作用。研究人员通过给予小鼠400 mg/ kg 的 APAP 体内注射后发现，小鼠在12 h 内表现出巨大的肝毒性，而肝脏功能的恢复却要在24 h 之后。注射 APAP 后转录因子 NF-E2相关因子2（ nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的表达量和在细胞核中的积累量都有增加。在注射APAP 后的第一个24小时内，醌NADH 脱氢酶1（NQO1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（ GCLM）和血红素氧合酶1（HO-1）的表达被抑制，然后抑制氧化应激反应。注射APAP 后，p53及其下游靶基因p21含量显著增加，但是在48 h 内又降至正常水平。此外，细胞周期蛋白D1、细胞周期依赖性激酶4（CDK4）、增殖细胞核抗原（PCNA）和肝再生增强因子（ ALR）水平在48 h 时明显增强，提示肝细胞增殖和组织修复的启动。这些结果表明，Keap1-Nrf2-ARE 和p53/ p21信号通路在对乙酰氨基酚引起肝损伤后肝再生中的作用。
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肝再生增强因子抑制肝非实质细胞TGF-β1表达的意义
目的 探讨肝再生增强因子(ALR)促进受损肝细胞增殖的机制.方法 采用免疫组化方法检测ALR对肝星状细胞和Kupffer细胞(KC)中TGF-β1表达的影响,Western blot法检测ALR对肝星状细胞表达TGF-β1的影响,细胞增殖试验(MTT法)观察经ALR刺激的大鼠肝星状细胞条件培养液(ICCM)、KC条件培养液(KCCM+)对受损肝细胞增殖的影响以及ALR对TGF-β1抑制受损肝细胞增殖的作用.结果 经ALR刺激后肝星状细胞和KC中TGF-β1免疫反应阳性信号减弱,Western blot显示ALR可抑制肝星状细胞表达TGF-β1.受损肝细胞经ICCM和KCCM刺激后增殖明显.ALR可拮抗TGF-β1对受损肝细胞增殖的抑制作用.结论 ALR可能通过抑制肝星状细胞和KC表达TGF-β1来促进受损肝细胞增殖.
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重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成
观察重组人肝再生增强因子(rhALR)对免疫损伤性肝纤维化的预防作用.建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型.在造模的同时予rhALR腹腔注射.观察大鼠存活率,血清ALT、AST、LDH水平,肝组织胶原蛋白含量及肝脏病理学改变.结果:rhALR可提高人血白蛋白免疫损伤性肝纤维化大鼠存活率;降低肝纤维化大鼠的ALT、AST、LDH水平;病理检查显示rhALR有明显减轻大鼠肝纤维化形成的作用;肝组织胶原蛋白含量的测定也表明rhALR预防组大鼠肝组织胶原蛋白含量明显低于模型组及阴性对照组.结论:重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成.
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重组腺病毒Ad-mALR和Ad-hALR的构建及其对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响
目的 构建含肝再生增强因子(ALR)基因的重组腺病毒并探讨其抗凋亡功能.方法 采用基因重组法构建重组穿梭载体pAdTrack-TO4-mALR和pAdTrack-TO4-hALR,同源重组法构建重组腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR,4轮扩增后获得高滴度Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR.将上述腺病毒感染L02细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达了解其感染率;Western blotting法检测ALR及Bcl-2/Bax蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测ALR对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR构建成功,且均能高效感染并稳定表达于L02细胞.与非感染组和感染空载病毒组相比,过表达ALR能促进L02细胞的增殖,并抵抗PA诱导的L02细胞凋亡作用,明显降低Bax,增加Bcl-2蛋白的表达.结论 ALR对寸L02细胞具有促增殖及抗PA诱导的细胞凋亡的作用.
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肝特异性生物活性肽研究进展
肝脏是人体内重要的器官之一,具有强大的再生能力.肝再生的调控机制非常复杂,众多因子参与其中,但大多数因子,类似肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)都不具备肝细胞作用的特异性.近年来,本实验室从新生小牛的肝脏中分离得到了能够特异性地促进肝细胞增殖、促进70%肝切除小鼠肝再生的物质并将其命名为HPPCn.因此,结合本实验室的工作对肝刺激物(HSS)、肝再生增强因子(ALR)、HPS、HPPCn等具有肝特异性作用的生物活性肽的研究进展以及相互之间的异同加以综述.
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肝再生增强因子研究进展
肝再生增强因子是一种新的肽类肝细胞辅助丝裂原,能促进肝再生.其同源基因广泛存在于各种生物体中.本文从肝再生增强因子的基因克隆与分子结构、组织分布与分泌方式、受体分布与信号转导和生物活性等方面进行综述,以加深对肝再生机制的了解.
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肝刺激物的研究进展
哺乳动物肝脏具有极其强大的再生能力,在肝再生的启动及进程中生长因子发挥了重要的作用.肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)是一种能特异的在体内外启动并促进肝细胞增殖和肝脏再生的活性物质,近30年来,国内外学者对动物源的HSS及人源肝细胞生成素(hepatopoietin, HPO)作了大量深入的实验研究,但始终未能分离到具生物活性的HSS纯品.在分离纯化HSS的研究过程中,人们发现了肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)等具肝再生刺激活性的物质,但它们与初得到的HSS粗提物在生物活性上仍有差别,近年来,本实验室克隆了一个具有体外促进肝细胞增殖的生长因子,并命名为HPO-X.本文主要结合本研究室的工作对HSS,HPO以及ALR的研究进展以及三者的异同加以综述.
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肝再生增强因子的研究进展
肝再生增强因子是近年来发现的一种能够通过免疫调控、信号转导及影响线粒体功能等方式特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子,且其基因家族成员广泛存在于从低级到高级的真核细胞中.近研究发现,其具有保护肝细胞、减轻毒物引起的肝脏损伤的作用.其机制可能与保护线粒体、抑制线粒体膜通透性转换孔开放有关.目前对其生物学性状、功能以及相关作用机制都有较深入的认识.
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大鼠肝再生增强因子的基因克隆
目的克隆大鼠肝再生增强因子(ALR)编码序列,并在原核细胞表达.方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT-PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白.结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALR cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质,与预期值一致.结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达.
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大鼠肝再生增强因子的基因克隆
目的 克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列,并在原核细胞表达.方法 按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT-PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片段亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导人到大肠杆菌后热诱导表达目的 蛋白.结果 从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15 kD大小的蛋白质,与预期值一致.结论 从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达.
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RT-PCR一步法克隆人肝再生增强因子基因
目的 采用RT-PCR一步法，克隆人肝再生增强因子(hALR)编码序列。方法 按文献报道人肝再生增强因子核苷酸序列合成引物，提取人胎肝组织总RNA，利用一步RT-PCR法扩增人肝再生增强因子编码区基因；将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒，构建原核表达载体。结果 获得长约400bp的hAIP cDNA编码区基因，序列分析表明与文献报道一致。结论 通过RT-PCR一步法成功克隆人肝再生增强因子基因，为制备人ALR基因工程产品及研究其多种生物学作用奠定了基础。
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肝再生增强因子在肾间质纤维化中的研究进展
肾纤维化，尤其是肾小管间质纤维化( RIF)是各种肾脏疾病发展致肾衰竭的共同途径[1]，其病变的程度与肾功能的损害程度密切相关。肾间质纤维化是一个缓慢的动态过程，涉及到各种细胞因子的释放、炎症细胞的浸润、肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化( EMT)、肾小管上皮细胞( RTEC)的凋亡、细胞外基质的过度积聚及降解失衡等因素。近年来，随着对肾间质纤维化的深入研究，发现ALR在抑制肾间质纤维化病理过程中发挥作用，且受到越来越多学者的关注。
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重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备
背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.
