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肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定
目的：建立稳定表达肝刺激因子（ hepatic stimulator substance，HSS）的BEL-7402肝癌细胞系，并对其生物学特性进行鉴定。方法采用脂质体法将鉴定后的Flag-HSS-pcDNA3．0质粒转染到肝癌细胞系BEL-7402中，进行G418筛选，获得稳定转染的人肝癌细胞系。通过real-time PCR、Western blotting和免疫荧光染色等方法鉴定HSS mRNA和蛋白质表达及亚细胞定位。结果免疫荧光染色实验证实HSS基因能在稳定转染的肝癌细胞系中表达，并定位于线粒体中。同时发现在稳定转染细胞中HSS mRNA和蛋白质的表达也均高于野生型BEL-7402细胞。结论目前已成功构建稳定转染HSS的BEL-7402肝癌细胞系。为深入研究HSS的生理功能提供实验工具和研究基础。
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CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达
目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.
关键词： 肝刺激因子 表皮生长因子 CCAAT/增强子结合蛋白α -
肝再生增强因子的研究进展
肝再生增强因子是近年来发现的一种能够通过免疫调控、信号转导及影响线粒体功能等方式特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子,且其基因家族成员广泛存在于从低级到高级的真核细胞中.近研究发现,其具有保护肝细胞、减轻毒物引起的肝脏损伤的作用.其机制可能与保护线粒体、抑制线粒体膜通透性转换孔开放有关.目前对其生物学性状、功能以及相关作用机制都有较深入的认识.
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前列腺素介导部分生长因子的促肝细胞分裂与细胞保护作用
肝细胞生长因子 (HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα) 以及肝刺激因子(HSS) 等作为有丝分裂剂,在肝细胞增殖和肝再生过程中起着重要的作用[1].近年来又有较多的研究证实,HGF、HSS等生长因子对肝毒剂(CCl4、半乳糖胺等) 损伤肝细胞具有细胞保护作用[2,3].另外,再生肝本身也具有很强的抗损伤能力,其机制之一就是再生肝中含有HSS等生长因子[4].
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肝刺激因子基因敲除促进非酒精性脂肪性肝炎发生发展的分子机制
目的 探讨肝刺激因子(HSS)基因敲除促进非酒精性脂肪性肝炎发生发展的分子机制.方法 运用改良DL-乙硫氨酸胆碱缺乏(CDE)高脂饮食法构建C57BL6-HSS-/和C57BL6-HSS+/+的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型各20只,另取C57BL6-HSS-/-和C57BL6-HSS+/+小鼠各20只为对照组,不予以造模.每组分别于1个月和2个月时处死小鼠10只并取材,运用ELISA法测定肝脏中三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)的含量;运用HE染色、Masson染色观察肝脏病理改变及胶原沉积;油红O染色观察和统计肝组织内脂质含量;运用实时荧光PCR和蛋白质印迹法检测肝组织中过氧化物酶体增殖物受体γ共辅激活因子1α(PGC-1α)、线粒体转录因子A(TFAM)、转录因子-E2相关因子α(Nrf2)、D环基因(D-loop)、动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、自噬相关基因3(Atg3)的mRNA和蛋白表达水平;检测肝组织内丙二醛(MDA)、环氧合酶Ⅳ(COXⅣ)和三磷酸腺甙(ATP)的含量;运用分光光度法测定呼吸链复合物Ⅴ和细胞色素C氧化酶活性.组间采用t检验.结果 C57BL6-HSS+/+组小鼠的HSS mRNA和蛋白水平分别为0.154±0.04和0.08±0.01,均显著低于C57BL6-HSS+/+组小鼠的0.952±0.08和1.362±0.130,两组比较差异均有统计学意义(t值分别为10.244、10.375,均P＜0.05).造模1个月和2个月,C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏中TC含量分别为(248.6±21.5)和(217.4±18.0) μmol/g,高于C57BL6-HSS+/+组的(153.5±11.2)和(140.8±7.5)μmol/g,两组比较差异均有统计学意义(t值分别为15.270和10.542,均P＜0.05).HE染色、油红O染色和Masson染色结果显示C57BL6 HSS /组小鼠肝组织内脂肪和胶原沉积以及炎性反应较C57BL6-HSS+/+组小鼠严重.造模1个月C57BL6-HSS-/组小鼠肝脏中Drp1、Fis1、Mfn1和Atg3的蛋白水平较C57BL6-HSS+/+组明显下降,差异均有统计学意义(t值分别为10.705、24.072、9.892、17.540,均P＜0.05);造模2个月C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏中Drp1、Fis1、Mfn1和Atg3的蛋白水平较C57BL6-HSS+/+组明显降低,差异均有统计学意义(t值分别为25.378、15.926、34.330、13.437,均P＜0.05).造模1个月C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏中Drp1、Fis1、Mfn1和Atg3的mRNA水平较C57BL6 HSS+/+组明显下降,差异均有统计学意义(t值分别为36.337、40.825、33.508、28.104,均P＜0.05);造模2个月C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏中Drp1、Fis1、Mfn1和Atg3的mRNA水平较C57BL6 HSS+/+组明显降低,差异均有统计学意义(t值分别为35.210、42.375、27.753、20.560,均P＜0.05).造模1个月和2个月,C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏内PGC-1α、TFAM、Nrf2、D-loop蛋白质水平均低于C57BL6 HSS+/+对照组,比较差异均有统计学意义(1个月:t值分别为20.548、31.036、19.445、10.974;2个月:t值分别为9.887、13.330、22.375、18.903;均P＜0.05);造模1个月和2个月,C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏内PGC-1α、TFAM、Nrf2、D-loop mRNA水平均低于C57BL6-HSS+/+组,比较差异均有统计学意义(1个月:t值分别为9.087、12.582、21.451、7.774;2个月:t值分别为23.758、17.924、9.924、15.209;均P＜0.05).造模1个月和2个月,C57BL6 HSS-/-组小鼠肝脏内ATP的表达量分别为0.063±0.001和0.054±0.002,与C57BL6-HSS+/+组小鼠的0.258±0.051和0.235±0.07比较差异均有统计学意义(t值分别为43.775、28.375,均P＜0.05);C57BL6-HSS /组小鼠肝脏内COXⅣ的表达量分别为0.142±0.06和0.068±0.001,与C57BL6-HSS+/+组小鼠的0.255±0.08和0.172±0.06,比较差异均有统计学意义(t值分别为28.337、19.782,均P＜0.05);C57BL6-HSS-/-组小鼠肝脏内MDA的表达量分别为0.973±0.112和1.253±0.054,与C57BL6-HSS+/+组小鼠的0.366±0.02和0.872±0.05,比较差异均有统计学意义(t值分别为8.357、6.582,均P＜0.05).结论 HSS缺失通过抑制线粒体融合,导致线粒体呼吸链功能异常、抑制脂肪酸氧化从而加重NASH的病程.
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肝刺激因子对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响
目的检测肝刺激因子(HSS)对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响.方法双参数流式细胞免疫荧光技术检测肝癌细胞EGFR/DNA的表达.结果 HSS下调肝癌细胞DNA表达,随时间延长下调程度逐渐增加,至24 h时DNA表达显著下降(P<0.05);HSS迅速下调EGFR表达,作用12 h即呈现显著差异(P<0.05).结论 EGFR/DNA表达的变化可能是HSS抑制肝癌细胞生长的原因之一.
关键词： 肝刺激因子 双参数流式细胞免疫荧光技术 肝癌细胞 -
肝刺激因子对人肝癌细胞BEL-7402 p21ras表达的影响
从雄性初断乳SD大鼠肝匀浆中提取肝刺激因子(HSS)并加以部分纯化, 观察其促人肝癌细胞增殖活性及对p21ras蛋白表达的影响.结果表明: (1) HSS具有明显的促人肝癌细胞增殖活性, 其分子量为14～20 kD; (2) HSS可提高p21ras蛋白表达, 具有时间-效应关系, 并与EGF呈协同作用; (3)HSS调节p21ras蛋白表达具有剂量-效应关系, 且呈现出饱和性.鉴于我们已报道HSS上调EGF受体蛋白和基因表达这一事实, 本实验结果进一步说明, HSS促人肝癌肝细胞增殖与其调节EGF受体介导的信号分子传导过程相关.
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肝刺激因子对肝癌细胞增殖的调节作用
初断乳雄性SD大鼠的肝匀浆以超速离心和柱层析法分离纯化肝刺激因子(HSS),观察其对肝癌细胞增殖、细胞表皮生长因子(EGF)受体表达及受体磷酸化的影响.结果表明,HSS具有明显的促肝癌细胞分裂增殖能力,提高细胞周期中S期细胞所占比例.HSS促肝癌细胞增殖作用与其促EGF受体表达有关,表现为:(1)HSS上调170 kD EGF受体蛋白表达,此作用与EGF合用后明显加强,即呈协同效应;(2)HSS上调EGF受体表达呈剂量-效应和时间-效应关系;(3)HSS可刺激EGF受体酪氨酸残基的磷酸化,调节受体活性.本研究结果提示,HSS可能是通过调节肝癌细胞EGF受体的表达及受体介导的信号传导通路而起到促增殖的作用.
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转染肝刺激因子基因增强肝癌细胞抗损伤作用研究
目的将人肝刺激因子基因(hHSS)转染BEL 7402肝癌细胞,探讨其增强细胞抗损伤的作用.方法于肝癌细胞中转染hHSS,并以MTT法检测转染细胞活性;采用CCl4和H2O2损伤细胞,测定细胞死亡率和凋亡率,以及丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性变化,观察转染细胞的抗损伤能力.结果hHSS表达的肝癌细胞增殖速度加快,同时转染h H S S细胞具有保护细胞免受两种毒剂的氧化损伤的能力,可以明显降低细胞死亡率及凋亡率[在CCl4-处理组和H2O2-处理组空载体对照凋亡细胞率分别为(32.44±0.52)%和(47.78±0.45)%,转染细胞凋亡率分别为(25.60±0.66)%和(37.40±0.69)%,t值分别为16.82和25.2,P＜0.01],并活化酪氨酸信号分子MAPK.结论hHSS基因的功能与刺激细胞增殖有关.
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肝刺激因子诱导BEL-7402肝癌细胞促分裂原活化蛋白激酶磷酸化
目的 观察肝刺激因子（hepatic stimulator substance, HSS）对肝细胞酪氨酸蛋白激酶介导信号传导的调节作用。方法自鼠肝提取HSS, 纯化后作用于BEL-7402肝癌细胞, 检测HSS对促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活性的影响。结果生物化学方法提取HSS与基因重组HSS分子量一致; HSS可活化MAPK, 其作用强度不及表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）; 以PD98059 (0～100μmol/L) 阻断MAPK信号通路后, HSS刺激MAPK的作用逐渐减弱, 呈剂量-效应关系。结论 HSS对酪氨酸激酶信号分子MAPK活性具有调节作用, 可能为其促肝细胞增殖的重要机制之一。
