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沙门菌效应分子SopB激活HeLa细胞MAPK蛋白激酶的磷酸化
目的 研究沙门菌感染宿主细胞的过程中,沙门菌Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白SopB对宿主细胞蛋白激酶MAPK的激活作用,同时寻找SopB蛋白与MAPK激活有关的结构域.方法 通过基因克隆的方法将沙门菌SopB全长基因以及各种SopB truncation均被克隆至pCS2-EGFP质粒载体中,利用磷酸钙转染法将该SopB重组质粒转染至HeLa细胞,24h后通过western blot方法利用磷酸化的pERK 1/2、p-p38以及pJNK抗体检测HeLa细胞MAPK蛋白激酶受SopB激活的情况.结果 在HeLa细胞中过量表达SopB蛋白能够显著诱导蛋白激酶MAPK的磷酸化激活,进一步在HeLa细胞中表达SopB各种truncation片段证实,SopB对HeLa细胞MAPK蛋白激酶的激活与其N末端29个氨基酸直接相关.结论 SopB可以激活宿主细胞MAPK信号途径,且这种活性与其N末端29个氨基酸有关.
关键词： 沙门菌属 丝裂原激活蛋白激酶类 蛋白激酶类 泛素化 磷酰化 -
抑癌基因PTEN在肝癌组织中的突变及其对肝癌细胞增殖和凋亡的调控作用
目的 探讨抑癌基因PTEN在人原发性肝癌组织中的突变及其对肝癌细胞增殖和凋亡的调控作用.方法 (1)聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)法和序列分析法检测42例人原发性肝癌组织中抑癌基因PTEN第5、8外显子的突变.(2)脂质体介导的基因转染法将野生型PTEN基因、突变型PTEN基因的真核表达载体pEGFP-wt-PTEN、pEGFP-PTEN;G129R分别转染不表达内源性PTEN蛋白的人肝癌细胞系HHCC,G418筛选稳定表达PTEN蛋白的克隆,MTT比色实验分析测定细胞的增殖能力.以未转染基因的HHCC细胞和转染空载体pEGFP-C1的HHCC细胞为对照.(3)TNF-α诱导上述细胞凋亡,流式细胞仪测定凋亡细胞比例;Western印迹法检测细胞内磷酸化Akt(Ser473)的表达.结果 (1)在4例肝癌组织中检测出PTEN基因第5外显子的异常突变条带(9.5%,4/42).(2)转染野生型PTEN基因的HHCC细胞生长明显抑制,而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞的增殖能力与对照组比较差异无统计学意义.(3)TNF-α诱导分别转染野生型、突变型PTEN基因、空载体的HHCC细胞和未转染基因的HHCC细胞凋亡,细胞凋亡率分别为13.8%、8.1%、4.6%、3.3%,与转染空载体的HHCC细胞比较,转染野生型PTEN基因的HHCC细胞凋亡率增高(P＜0.05);而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).Western印迹检测显示未经基因转染的HHCC细胞内源性Akt水平较低;HHCC细胞经TNF-α作用,其内源性Akt水平增高;转染野生型PTEN基因,可降低TNF-α诱导的肝癌细胞内信号分子Akt(Ser473)的磷酸化水平.结论 (1)首次发现原发性人肝癌组织中抑癌基因PTEN发生突变;(2)野生型PTEN基因可抑制肝癌细胞增殖,而突变型PTEN基因丧失对肝癌细胞增殖的调控作用;(3)野生型PTEN基因可降低TNF-α诱导的肝癌细胞内重要的信号分子Akt(Ser473)的磷酸化水平,即野生型PTEN基因通过抑制TNF-α诱导的肝癌细胞Akt磷酸化(活化)而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.
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AKT/mTOR通路在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的活化及其与临床病理相关性的研究
目的 研究AKT/mTOR通路在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的活化及其与bcl-6基因表达等指标的相关性,并探讨其在不同类型DLBCL中的作用.方法 用免疫组织化学方法 检测100例DLBCL及10例淋巴结反应性增生新鲜组织中pAKT、pmTOR的表达;运用TaqMan即时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)技术检测上述DLBCL中bcl-6 mRNA含量;同时用免疫组织化学方法 观察其中75例相应石蜡组织中bcl-6、CD10和MUM1的表达并据此进行分型.结果 (1)pAKT和pmTOR在DLBCL中的阳性率分别为76.0%(76/100)和75.0%(75/100),二者的表达强度、阳性细胞分布一致.(2)bcl-6蛋白与mRNA表达水平显著相关.pAKT和pmTOR高表达组的bel-6蛋白阳性率与mRNA水平均低于pAKT和pmTOR低表达或不表达者(均P<0.01).(3)非生发中心B细胞样(non-GCB)型DLBCL中pAKT和pmTOR的阳性率分别为82.5%(47/57)和84.2%(48/57),高于GCB型中的阳性比8/18和8/18(均P<0.01).(4)pAKT和pmTOR在男性患者中的表达略高于女性患者,pAKT和pmTOR阳性患者中乳酸脱氢酶(LDH)异常者略高于阴性患者中的比例,但差异均没有统计学意义(P>0.05).pAKT和pmTOR的表达与年龄、临床分期、卡氏体力状况评分(KPS)、B症状之间没有相关性(P>0.05).结论 AKT/mTOR信号转导通路活化在DLBCL发生中起重要作用,特别与bel-6低表达或不表达以及non-GCB亚型密切相关,并有望成为部分DLBCL治疗的新靶点.
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上皮性卵巢癌中磷酸化蛋白激酶B和磷酸化糖原合成酶激酶-3β及β-catenin蛋白的表达及意义
目的 研究磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β( p-GSK3β)和β-catenin在卵巢上皮性肿瘤中的表达,探讨其与卵巢上皮性肿瘤临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学EnVision二步法检测10例卵巢良性上皮性肿瘤、10例卵巢交界性上皮性肿瘤及70例上皮性卵巢癌中p-AKT、p-GSK3β及β-catenin的表达,并分析它们的相关性及与临床病理特征的关系.结果 (1)卵巢癌组织中p-AKT、p-GSK3β及β-catenin的阳性表达率分别为67.1％( 47/70)、60.0％ (42/70)和71.4％ (50/70),三者在卵巢癌组的表达水平与其他两组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05).p-AKT与p-GSK3β、p-GSK3β与β-catenin、p-AKT与β-catenin在卵巢癌中的表达均呈正相关(r值分别为0.546、0.581、0.500;P值均＜0.05).(2)p-AKT在上皮性卵巢癌组织中的表达水平与交界性和良性肿瘤相比,差异均有统计学意义(均P ＜0.05).p-AKT与卵巢癌的分化程度密切相关(P＜0.05),而与卵巢癌的组织学分型及临床分期无统计学相关性(P＞0.05).(3)p-GSK3β和β-catenin在卵巢癌中的表达水平均高于交界性和良性肿瘤,差异有统计学意义(均P＜0.05)；且其表达与卵巢癌的分化程度及临床分期密切相关(均P ＜0.05),而与卵巢癌的组织学分型无统计学相关性(均P＞0.05).结论 在卵巢癌组织中p-AKT、p-GSK3β和β-catenin蛋白的表达具有正相关性,p-AKT结合p-GSK33并使其失活可能是导致卵巢癌中β-catenin活化的一个因素.
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子宫内膜癌中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶通路活化及临床意义
目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶( PI3 K/AKT)信号通路的重要组分PTEN、PIK3CA和p-AKT在子宫内膜癌组织中的改变及其预后意义.方法 免疫组织化学EnVision二步法检测PTEN、p-AKT、雌激素受体(ER)和孕激素受体在71例子宫内膜癌组织中的表达,聚合酶链反应测序法分析其中34例PIK3CA基因外显子9和20的突变情况.结果 (1)71例子宫内膜癌组织中,子宫内膜样癌( EEC) 65例,非子宫内膜样癌(NEEC)6例.PTEN失表达率为63.4％( 45/71),在EEC中的比例(66.2％,43/65)高于NEEC( 2/6；P=0.18).PTEN失表达患者(45例)预后优于PTEN正常表达者(26例；P=0.07).进一步分组分析显示在ER阴性病例中,PTEN失表达者(12例)的预后优于PTEN正常表达者(7例),差异有统计学意义(P=0.04).(2)本组34例中PIK3CA突变率为41.2％ (14/34),突变热点为外显子9的T544.PIK3CA突变在EEC中的发生比例(44.8％,13/29)高于NEEC( 1/5；P ＞0.05).外显子9突变全部见于Ⅰ期EEC病例中,且在高、中分化的EEC中发生率高于低分化肿瘤(P＞0.05).外显子20突变在早期病例组(14.3％,4/28)的发生率显著低于晚期病例组(4/6；P=0.0l).(3)p-AKT的阳性率为59.2％ (42/71),在EEC中的阳性率(60.0％,39/65)高于NEEC(3/6；P=0.68)；但高、中分化组EEC的阳性比例(75.0％,21/28；53.6％,15/28)高于低分化组(3/9),差异有统计学意义(P=0.02).p-AKT阳性与ER阳性相关(r=0.339,P=0.00).结论 PI3K/AKT信号通路的关键分子,如PTEN失表达、p-AKT阳性提示预后好.PIK3CA基因外显子9和20的突变对子宫内膜癌的预后影响可能不同.子宫内膜癌中PTEN和p-AKT的功能可能受到ER状态的影响.
关键词： 子宫内膜肿瘤 1-磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白激酶类 突变 预后 -
蛋白激酶CK2α对鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力的影响
目的 探讨蛋白激酶CK2α对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的作用,并探讨其可能机制.方法 通过RNA干扰技术下调鼻咽癌5-8F细胞中CK2α蛋白的表达,利用Western blot方法验证干扰效果;采用四甲基偶氮唑盐体外增殖实验、体外肿瘤侵袭实验方法检测CK2α下调后对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响;应用流式细胞术检测细胞增殖周期的变化;Western blot方法分析CK2α对Akt蛋 白磷酸化的影响.结果 通过RNA干扰技术可以有效的沉默CK2α的表达.CK2α表达下调后,鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力显著下降.细胞周期结果显示,CK2α沉默后,G0/G1期细胞比率增加,S期细胞比率降低.Western blot结果显示,CK2α沉默后下调了磷酸化Akt蛋白的表达水平.结论 蛋白激酶CK2α与鼻咽癌增殖、侵袭密切相关,CK2α可能是一个有潜力的鼻咽癌治疗靶点.
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AKT蛋白激酶活化对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞生物学行为影响的体外研究
目的 观察AKT及磷酸化AKT(pAKT,即AKT呈活化状态))蛋白激酶在三个弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株中的表达状态,并探讨其与DLBCL细胞生物学行为的关系以及PI3K抑制剂LY294002对该瘤细胞生长的影响.方法 采用Western blot检测DLBCL细胞株ly1、ly8、ly10在有血清和无血清培养条件下AKT和pAKT的表达状态;用PI3K抑制剂LY294002分别作用于三株细胞,观察pAKT水平的改变;用流式细胞术结合碘化丙啶(PI)单染分析细胞周期、AnnexinⅤ-异硫氢酸荧光素(FITC)染色检测细胞凋亡、BrdU法观察细胞增殖状态的改变.结果 三株DLBCL细胞株在不同的培养条件下均显示有pAKT,在10%FBS培养组ly8和ly10之pAKT水平高于无血清培养组;而ly1相反,在无血清培养组pAKT略高于有血清培养组.在有血清培养组,LY294002可明显降低三细胞株细胞的pAKT水平,并显示S期细胞明显减少(P＜0.05),G0～G1期细胞增加,增殖细胞比例显著降低(P＜0.05),以ly8、ly10细胞尤为明显;但凋亡细胞无明显增加(P＞0.05).结论 AKT活化与DLBCL细胞周期和细胞增殖密切相关;与细胞凋亡无显著相关;LY294002可通过降低DLBCL细胞的pAKT水平继而抑制瘤细胞生长.
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SHP2和MKP5在P2Y嘌呤受体介导的人前列腺癌细胞侵袭中的调控机制研究
目的探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶(SHP2)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5(MKP5)在P2Y嘌呤受体激活人不同转移潜能的前列腺癌细胞系MAPKs信号通路中的调节机制及其与细胞侵袭能力的相关性.方法构建野生型和突变型SHP2及野生型MKP5表达质粒并分别稳定转染入1E8(高转移)和(或)2B4(不转移)细胞.应用免疫沉淀法检测细胞SHP2的酪氨酸磷酸化的程度,免疫印迹法检测ERK1/2 、p38 的磷酸化,用Matrigel穿膜实验检测细胞的体外侵袭能力.结果 ATP可刺激细胞的SHP2发生磷酸化,且在1E8中的激活程度高于2B4.野生型SHP2转染可使2B4细胞中ATP 对 ERK1/2 的激活时效明显延长;而突变型SHP2延迟并降低1E8细胞中ATP对ERK1/2的激活水平;两者对细胞p38的活性均无明显影响.ATP刺激可使不转移 2B4细胞穿膜数明显增多(比对照组增加72.2%±14.0%),野生型SHP2转染可使经ATP刺激的细胞穿膜数进一步增加18.7%.ATP刺激可使高转移1E8细胞穿膜数进一步增加(112.8%±32.0%),而转染突变型SHP2可部分(40.9%)抑制ATP的促细胞侵袭作用.转染野生型 MKP5 在明显抑制p38磷酸化的同时,也能部分抑制 ATP 的促侵袭作用(抑制率在1E8和2B4分别为22.4%和28.7%).结论 SHP2正性调节P2Y嘌呤受体介导的ERK活化,并可促进前列腺癌细胞的侵袭能力.而MKP5通过抑制P2Y嘌呤受体介导的p38活化并降低细胞的侵袭能力.SHP2和MKP5 可以针对MAPKs的不同靶点对前列腺癌细胞的侵袭发挥不同的调控功能.
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CVB 2A蛋白酶抑制帽样结构依赖的蛋白翻译
目的 探讨CVB3的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译和内部核糖体进入位点(IRES)翻译机制的影响.方法 构建表达载体pcDNA3.1-2A,将此表达载体分别与pEGFP-N1、pGL3(F-luc)以及pIRES-GFP载体共转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,检测荧光素酶蛋白的表达.Western Blot检测CVB3病毒和pcDNA3.1-2A对真核生物翻译起始因子4GI(eIF4GI)及多聚A尾结合蛋白(PABP)的影响.结果 pcDNA3.1-2A可以减少帽样依赖的GFP和荧光素酶蛋白的表达,但可以促进IRES依赖的GFP表达.CVB3 2A基因质粒转染和CVB3感染后,均可发现细胞内eIF4G的切割现象;同时CVB3对PABP也有降解作用,而CVB32A基因转染对PABP无明显作用.结论 CVB3的蛋白酶2A抑制真核细胞帽样途径蛋白翻译,促进IRES途径的翻译.
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羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中AMPK-ULK1自噬调节通路的研究
目的 研究感染羊瘙痒因子139A的小鼠脑组织中自噬的活化及其机制.方法 采用Western Blot方法检测感染羊瘙痒因子139A的小鼠终末期脑组织匀浆中的AMPK、ULK1及其磷酸化水平和LC3 Ⅱ的表达,并对其进行定量分析.结果 感染139A毒株的小鼠脑组织终末期脑组织中AMPK、ULK1及其磷酸化水平均表达升高.同时发现LC3 Ⅱ水平增加.结论 AMPK-ULK1通路在139A感染的小鼠脑组织中活化并且有可能对自噬的激活起到了重要的作用.
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前列腺癌细胞株PC-3中PKB信号通路拮抗TGF-β信号
目的 研究前列腺癌中蛋白激酶B(PKB)信号通路对转化生长因子β(TGF-β)信号通路的调节作用,探讨两信号通路在前列腺癌发生发展中的作用.方法 通过生长抑制实验、细胞周期停滞实验、荧光素酶报告基因、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫共沉淀检测PC-3细胞中PKB信号通路对TGF-β信号的调节作用.结果 PKB信号通路可以抑制TGF-β反应性的CAGA报告基因活性;应用LY294002(PKB通路特异性抑制剂)可以增强TGF-β抗增殖和诱导细胞周期停滞作用;PKB信号通路的活化和抑制均不能影响TGF-β通路信号分子的表达;LY294002和TGF-β可以协同抑制cyclinD1的表达;LY294002增强TGF-β诱导的P15表达;PKB与Smad3之间存在蛋白质相互作用.结论 PKB信号通路通过调节cyclinD1和P15的表达拮抗TGF-β诱导的抗增殖和诱导细胞周期停滞作用,Smad3与PKB的相互作用可能介导了该作用.PKB信号通路通过上述拮抗性作用促进了前列腺癌的发生发展.
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Akt和磷酸化Akt1在胰腺癌组织中的表达及意义
目的 了解Akt和磷酸化Akt1(p-Akt1)蛋白在胰腺癌组织中的表达情况,探讨其临床意义.方法 应用免疫组织化学法检测74例胰腺癌组织、10例正常胰腺组织中Akt和p-Akt1蛋白的表达,并分析其与临床病理学特征及预后的关系.结果 Akt和p-Akt1蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为87.8%和83.8%,而正常胰腺组织均阴性表达,相差非常显著(P<0.05).癌组织中Akt和p-Akt1蛋白的表达呈正相关性(r=0.274,P=0.018).Akt和p-Akt1蛋白表达与年龄、性别、肿瘤生长部位、肿瘤大小、病理学分级、淋巴结转移、临床分期及神经浸润均无显著相关性(P>0.05),但p-Akt1蛋白高表达与病理学T分期及TNM分期相关(P=0.002).Akt和p-Akt1蛋白高表达者的中位生存期分别为(16.0±5.7)个月和(23.0±5.5)个月,明显高于低表达者的(9.3±0.2)个月和(11.1±1.8)个月(P分别为0.007和0.004).结论 胰腺癌组织中p-Akt1蛋白表达的程度与良性预后有关,检测胰腺癌中p-Akt1蛋白的表达具有一定的临床意义.
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胰腺癌组织TGF-β1、ERK1、ERK2和c-jun的表达及意义
目的研究TGF-β1、ERK1、ERK2和c-jun在胰腺癌组织和对照组织中的表达特征、相互关系及其临床意义.方法应用S-P法检测45例胰腺癌20例对照组(16例胰腺良性病变和4例正常胰腺)组织中TGF-β1、ERK1、ERK2和c-jun的表达.结果 TGF-β1在人胰腺癌组织中的阳性表达率为66.67%(30/45),对照组的阳性率为30%(6/20),两者比较有显著差异;ERK1和ERK2在胰腺癌组织的阳性表达率分别为86.7%(39/45)和84.44%(38/45),在对照组的阳性率分别为30%(6/20)和20%(4/20),两者比较有显著差异;c-jun在胰腺癌中的阳性表达率为75.6%(34/45),对照组的阳性率是10%(2/20),两者之间有显著差异.c-jun及TGF-β1高表达与肿瘤转移相关.TGF-β1与ERK1/2之间、ERK1与ERK2之间、c-jun与ERK1/2之间均有相关关系.结论胰腺癌组织中TGF-β1、ERK1、ERK2及c-jun蛋白表达均有显著性改变,这些蛋白的检测可为胰腺癌早期诊断及预后判断奠定基础;TGF-β1、ERK1/2及c-jun这一TGF-β转导通路在胰腺癌的发生、发展及转移过程中起重要作用.
关键词： 胰腺肿瘤 转化生长因子β 蛋白激酶类 原癌基因蛋白质c-jun -
蛋白激酶介导的系膜细胞内钙变化在早期糖尿病鼠肾小球高滤过中的作用
目的探讨早期糖尿病肾病(DN)系膜细胞(GMC)收缩功能的变化及其与肾小球高滤过的关系. 方法 Wistar大鼠正常组和糖尿病(DM)2周组,采用STZ诱导DM模型,进行成模后GMC培养,与体外高糖刺激系膜细胞对照,用Fluo-3荧光标记GMC,共聚焦显微镜测定GMC胞浆内基础Ca2+水平,动态观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激Ca2+水平的变化,以及抑制蛋白激酶C(PKC)对Ca2+水平的影响. 结果 DM鼠的肌酐清除率(Ccr)在2周时明显升高.DM2周组GMC内基础Ca2+水平低于正常,高糖组Ca2+水平无明显下降,但各组对AngⅡ刺激反应均较正常有不同程度降低,以2周组为显著.佛波酯作用24 h能恢复2周组基础Ca2+水平,部分恢复各组AngⅡ刺激引起的GMC内Ca2+水平上升反应. 结论细胞内钙紊乱是GMC收缩失调的主要机制之一;PKC活化参与了GMC的收缩过程.GMC的收缩功能变化在DN早期肾小球高滤过的发生中起重要作用.
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白细胞介素-8对缺氧脐静脉内皮细胞存活、凋亡的影响及机制
目的：通过氯化钴构建缺氧脐静脉内皮细胞模型，探讨白细胞介素-8（IL-8）对缺氧脐静脉内皮细胞存活、凋亡的影响及机制。
方法：体外培养脐静脉内皮细胞加入不同浓度氯化钴或IL-8孵育，检测细胞存活率。正常或缺氧内皮细胞加入IL-8或同时加入IL-8抗体/蛋白激酶B（Akt）抑制剂LY294002孵育48 h，采用四唑盐比色法检测细胞存活率；用流式细胞术连接素V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-FITC/ PI）双染标记法检测细胞凋亡；蛋白免疫印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、磷酸化Akt（pAkt）和磷酸化糖原合成酶激酶3βser9（pGSK-3βser9）蛋白表达。
结果：低浓度氯化钴（50，100μmol/L）孵育人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）12 h可促进细胞增殖（P<0.01）；而高浓度氯化钴（200，400μmol/L）孵育24 h和48 h则均明显减少内皮细胞存活。10、50和100 ng/ml的IL-8分别孵育内皮细胞48 h和72 h均可明显改善缺氧对脐静脉内皮细胞存活率的影响，细胞存活增加（P<0.01）。10 ng/ml的IL-8可显著抑制正常和缺氧细胞的凋亡和下调caspase-3水平，上调pAkt和pGSK-3βser9水平（P<0.01）；而LY294002或IL-8抗体均可拮抗IL-8的上述作用（P<0.01）。
结论：IL-8可通过下调caspase-3水平，上调pAkt和pGSK-3βser9水平，从而抑制缺氧内皮细胞的凋亡、促进细胞存活。 -
三磷酸腺苷后处理对兔心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究
目的 观察ATP后处理对再灌注损伤挽救激酶信号通路中的蛋白激酶B(Akt)及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)表达的影响,探讨ATP后处理的心血管保护效应及可能机制.方法 选择48只健康新西兰白兔,随机分为缺血再灌注组(再灌注组)、ATP后处理组(后处理组)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂Wortmannin+ ATP后处理组(Wortmannin+ ATP组)、ERK1/2抑制剂PD98059+ ATP后处理组(PD98059+ ATP组),每组12只.建立兔急性心肌缺血再灌注模型.实验终点检测各组心肌梗死面积、细胞凋亡指数,Western blot法检测心肌p-Akt,p-ERK1/2蛋白表达.结果 后处理组心肌梗死面积、细胞凋亡指数明显低于再灌注组(P＜0.01).Western blot检测显示,后处理组p-Akt、p-ERK1/2表达水平明显高于再灌注组(P＜0.05).结论 ATP后处理可以减轻兔缺血再灌注心肌的梗死面积,降低细胞凋亡指数,同时上调p-Akt和p-ERK1/2的表达,提示PI3K/Akt及ERK1/2信号通路参与了ATP后处理对兔缺血再灌注心肌的保护作用.
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丹酚酸A对大鼠脑缺血再灌注损伤后胞浆型磷脂酶A2表达的影响及机制研究
目的 探讨丹酚酸A对大鼠脑缺血再灌注损伤后胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)表达的影响及其机制.方法 将SD大鼠65只,随机分为对照组,模型组、丹酚酸A组和联合组(LY294002+丹酚酸A).分别于再灌注后0、8、24、48 h取梗死脑组织,用TUNEL检测脑细胞凋亡,免疫组织化学检测cPLA2表达,Western blot检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt在脑组织表达水平.结果 模型组和联合组0、8、24、48 h海马CAl区TUNEL阳性细胞和cPLA2表达较对照组明显增高,脑组织磷酸化Akt表达较对照组明显降低(P＜0.05).丹酚酸A组0、8、24、48 h脑组织磷酸化Akt表达较模型组明显增高,TUNEL阳性细胞和cPLA2表达较模型组明显降低[(10.1±5.3)个/mm2 vs (12.8±4.7)个/mm2、(14.6±6.2)个/mm2 vs (30.1±7.5)个/mm2、(19.7±6.5)个/mm2 vs (73.8±11.4)个/mm2、(22.8±9.6)个/mm2 vs (94.6±15.2)个/mm2,(13.6±3.1)个/mm2 vs (41.3±3.6)个/mm2、(14.8±4.7)个/mm2 vs (62.5±6.9)个/mm2、(16.6±7.1)个/mm2 vs (72.3±9.6)个/mm2、(17.0±5.3)个/mm2 vs (83.2±11.7)个/mm2,P＜0.05].结论 丹酚酸A通过Akt信号通路,降低脑缺血再灌注后脑组织中cPLA2表达,减少脑细胞凋亡,发挥细胞保护作用.
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蛋白激酶GIa基因在蛛网膜下腔出血后对血管调控作用的研究
目的 观察血性脑脊液对大鼠脑动脉平滑肌细胞(CASMC)的促增殖作用以及携带蛋白激酶GIa(PKGIa)基因的重组腺病毒载体(Ad-PKGIa)的干预作用,探讨PKGIa基因在蛛网膜下腔出血后继发慢性脑血管痉挛分子机制中可能的调控作用.方法 相同密度(106/cm2)接种后分为血性脑脊液组(B组)、生理盐水转染组(AN组)、血性脑脊液空载体组(KB组)和血性脑脊液转染组(AB组).另设生理盐水对照组(N组).采用组织块法原代培养CASMC.采用RT-PCR和Western blot检测Ad-PKGIa转染CASMC后PKGIa基因的表达.采用MTT法、3H-TdR掺入法检测血性脑脊液对CASMC增殖的刺激作用以及Ad-PKGIa的抑制作用.结果 与转染前比较,Ad-PKGIa转染后1d,CASMC内PKGIa mRNA水平和蛋白表达明显增高(P<0.05).与N组比较,B组、KB组3H-TdR和MTT明显增多和升高(P<0.05);与B组比较,AN组和AB组3H-TdR和MTT明显减少和降低(P<0.05);与KB组比较,AB组3H-TdR和MTT明显减少和降低(P<0.05).结论 PKGIa信号途径在蛛网膜下腔出血后,继发慢性脑血管痉挛分子机制中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.
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线粒体融合素2突变体对血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的 研究大鼠线粒体融合素2(mitofusin 2,Mfn2)基因蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点的2种突变体对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡及其相关的信号通路的影响.方法 构建4种重组腺病毒,分别携带磷酸化位点突变为丙氨酸(重组1组)、Mfn2基因(重组2组)、突变为天冬酰胺(重组3组)和半乳糖苷酶基因(对照组),感染培养的VSMCs,另设未感染腺病毒的空白组.流式细胞术比较各组细胞的凋亡率,JC-1染色法检测线粒体膜电位变化,Western blot分析各组Mfn2蛋白的表达以及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和活性半胱天冬酶9(caspase-9)表达.结果 与空白组和对照组比较,重组1组、重组2组和重组3组Mfn蛋白显著增加(P<0.01);重组1组和重组2组细胞凋亡率显著增强(P<0.01);线粒体膜电位显著降低(P<0.01);p-Akt表达水平显著降低(P<0.01),活性caspase-9表达水平显著增高(P<0.01);且重组1组作用较重组2组更明显(P<0.01);而重组3组上述指标无显著差异(P>0.05).结论 Mfn2突变为丙氨酸的位点PKA通过Akt信号及线粒体途径诱导VSMCs凋亡的作用较Mfn2更明显,表明PKA磷酸化位点是调控Mfn2诱导VSMCs凋亡的重要功能位点.
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蛋白激酶B信号通路的干预在慢性脑低灌注大鼠中的作用及对海马细胞凋亡的影响
目的 探讨蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Akt/GSK3β)信号通路是否参与慢性脑低灌注(CCH)大鼠海马细胞凋亡过程.方法 选择SD大鼠60只,随机分为假手术组、CCH组、LY294002组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)组,每组15只,后3组制作大鼠CCH模型,LY294002组和IGF-1组分别以抑制剂LY294002及激动剂IGF-1进行干预.采用TUNEL检测海马细胞凋亡;Western blot法检测Akt、GSK3β、磷酸化Akt (P-Akt)和磷酸化GSK3β(P-GSK3β)表达.结果 与假手术组比较,CCH组、LY294002组及IGF-1组细胞凋亡水平均升高(P＜0.05);与CCH组比较,LY294002组细胞凋亡数明显增高(20.33±1.52 vs 15.00±1.00,P＜0.05),而IGF-1组细胞凋亡数降低(12.00±1.73 vs 15.00±1.00,P＜0.05).与假手术比较,CCH组和IGF-1组P-Akt,P-GSK3β均明显增高(P＜0.05),而LY294002组无明显变化(P＞0.05);与CCH组比较,IGF-1组P-Akt,P-GSK3β表达量均升高(P＜0.05);LY294002组均降低(P＜0.05).结论 Akt/GSK3β信号通路参与CCH大鼠海马细胞凋亡过程,上调该通路Akt与GSK3β这2种蛋白的磷酸化表达水平,可能是拮抗这种细胞凋亡方式之一.
