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有机磷农药中毒机理研究进展
有机磷化合物做为农用杀虫剂开发应用已半个多世纪,由于其品种繁多,杀虫效果好,在有机合成农药中占有极重要地位.但随之带来的人畜中毒,促进了对其中毒防治的不断深入研究,从而较清楚地揭示了有机磷进入体内,通过神经末稍的胆碱酯酶磷酰化使其失活,造成乙酰胆碱大量蓄积在胆硷能神经与效应器接点,发生毒蕈硷样与烟硷样效应及中枢神经系统症状.又根据此中毒机理,结合实践订出有机磷中毒诊断标准,并研制了解毒剂,提出一整套中毒抢救措施,挽救了无数的生命.但随着科技手段的不断更新,研究仍在继续深入.文献较集中于以下三个方向的研究.
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响应面法优化磷酸酯化龙眼肉多糖的制备工艺
目的:优选磷酸酯化龙眼肉多糖的制备工艺.方法:选取三氯氧磷(POCl3)进行磷酰化反应制备磷酸酯化龙眼肉多糖,以磷钼蓝法测定的取代度为指标,采用单因素试验和响应面法对吡啶与POCl3的体积比、反应温度,反应时间进行优化,确定佳制备工艺.结果:佳制备工艺为吡啶-POCl33∶1,反应温度0℃,反应时间60 min,龙眼肉多糖磷酸酯化取代度高达0.018 4.结论:优选的磷酸酯化龙眼肉多糖制备工艺稳定可行,可推广于大生产应用.
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沙门菌效应分子SopB激活HeLa细胞MAPK蛋白激酶的磷酸化
目的 研究沙门菌感染宿主细胞的过程中,沙门菌Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白SopB对宿主细胞蛋白激酶MAPK的激活作用,同时寻找SopB蛋白与MAPK激活有关的结构域.方法 通过基因克隆的方法将沙门菌SopB全长基因以及各种SopB truncation均被克隆至pCS2-EGFP质粒载体中,利用磷酸钙转染法将该SopB重组质粒转染至HeLa细胞,24h后通过western blot方法利用磷酸化的pERK 1/2、p-p38以及pJNK抗体检测HeLa细胞MAPK蛋白激酶受SopB激活的情况.结果 在HeLa细胞中过量表达SopB蛋白能够显著诱导蛋白激酶MAPK的磷酸化激活,进一步在HeLa细胞中表达SopB各种truncation片段证实,SopB对HeLa细胞MAPK蛋白激酶的激活与其N末端29个氨基酸直接相关.结论 SopB可以激活宿主细胞MAPK信号途径,且这种活性与其N末端29个氨基酸有关.
关键词： 沙门菌属 丝裂原激活蛋白激酶类 蛋白激酶类 泛素化 磷酰化 -
有机磷农药中毒的抢救及护理体会
有机磷进入体内与胆碱酯酶迅速结合,形成磷酰化胆碱酯酶,使体内胆碱酯酶的活性受抑制而丧失了分解乙酰胆碱的作用,造成大量乙酰胆碱在体内蓄积,引起胆碱能神经的过度兴奋,导致神经功能紊乱,临床上产生一系列症状及特征.
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19例急性有机磷中毒患者的抢救与护理
有机磷农药种类很多,根据其毒性强弱分为高度、中毒、低毒3类.其中包括敌敌畏、敌百虫、乐果等等,其毒理作用大致相同,进入人体后,以其磷酰基与乙酰胆碱酯酶的活性部分紧密结合,形成磷酰化胆碱酯酶而丧失分解乙酰胆碱的能力,以致体内乙酰胆碱人量蓄积,表现为中枢神经系统的一系列症状和体征.
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胰岛素受体底物1表达及其酪氨酸磷酸化与妊娠期糖尿病患者胰岛素抵抗的关系
目的 探讨骨骼肌组织中胰岛素受体底物1(IRS-1)表达及其酪氨酸磷酸化与妊娠期糖尿病发生胰岛素抵抗的关系.方法 采用蛋白印迹法(western blot)及免疫沉淀法检测22例妊娠期糖尿病患者(妊娠期糖尿病组)、22例正常妊娠妇女(正常妊娠组)及13例正常非孕妇女(正常非孕组)骨骼肌组织中IRS-1蛋白表达水平及其酪氨酸磷酸化程度;采用放射免疫法及葡萄糖氧化酶法检测各组妇女空腹胰岛素(FINS)及空腹血糖(FPG)水平,并采用稳态模型法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).结果 (1)妊娠期糖尿病组FPG、FINS、HOMA-IR分别为(5.6±0.8)mmol/L、(15.4±5.1)mU/L、1.2±0.5,正常妊娠组分别为(4.4±0.5)mmol/L、(10.6±3.1)mU/L、0.8±0.3,两组间各指标分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);正常非孕组FINS、HOMA-IR分别为(7.6±2.3)mU/L、0.5±0.3,分别与正常妊娠组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)妊娠期糖尿病组IRS-1蛋白表达水平为0.64±0.11,明显低于正常妊娠组的0.81±0.13,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);正常非孕组IRS-1蛋白表达水平为0.83±0.12,与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(3)妊娠期糖尿病组基础及胰岛素刺激后的IRS-1酪氨酸磷酸化程度分别为0.35±0.12及0.48±0.14,均低于正常妊娠组的0.38±0.13及0.66±0.12,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);正常妊娠组胰岛素刺激后的IRS-1酪氨酸磷酸化程度明显低于正常非孕组的0.85±0.09(P＜0.01).(4)妊娠期糖尿病组IRS-1蛋白表达水平和胰岛素刺激后的酪氨酸磷酸化程度与HOMA-IR呈明显负相关(r=-0.613,-0.632;P＜0.01);正常妊娠组胰岛素刺激后酪氨酸磷酸化程度与HOMA-IR呈明显负相关(r=-0.526,P＜0.05).结论 骨骼肌组织中IRS-1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度异常,是妊娠期糖尿病患者发生胰岛素抵抗的分子机制之一.
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子宫内膜癌组织中胰岛素受体底物1的表达与活化及其临床意义
目的 研究子宫内膜癌组织中胰岛素受体底物1(ⅡlS-1)mRNA、蛋白的表达水平及酪氨酸磷酸化程度,并探讨其临床意义.方法 选择63例子宫内膜癌(内膜癌组)、21例子宫内膜不典型增生(不典型增生组)及22例正常子宫内膜(正常内膜组)患者进入本研究.收集其临床病理资料,酶联免疫法检测空腹血清胰岛素C肽水平,RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测子宫内膜组织中1RS.1 mRNA及蛋白的相对表达量,免疫共沉淀法检测IRS-1酪氨酸磷酸化程度.结果 内膜癌组患者血清C肽水平为(3.2±1.1)μg/L,高于正常内膜组[(2.5±0.7)μg/L],两组比较,差异有统计学意义(P=0.007).内膜癌、不典型增生及正常内膜组IRS-l mRNA、蛋白的相对表达量比较,差异均无统计学意义(F=0.695、0.003,P=0.502、0.997).内膜癌组IRS-1酪氨酸磷酸化程度[(62±36)%]高于不典型增生及正常内膜组[分别为(53士34)%、(35±33)%],分别比较,差异均有统计学意义(P=0.048、0.002);不典型增生组与正常内膜组比较,差异也有统计学意义(P=0.045).子宫内膜样腺癌患者IRS-1酪氨酸磷酸化程度[(69±33)%]高于非内膜样癌[(34±31)%],两者比较,差异有统计学意义(t=2.300,P=0.025).高手术病理分期、细胞分化不良、深肌层浸润及盆腔淋巴结转移者IRS-1酪氨酸磷酸化程度增高(P均<0.05).子宫内膜组织中IRS-1酪氨酸磷酸化程度与空腹血清C肽水平呈正相关关系(r=0.491,P=0.001).结论 子宫内膜癌组织中IRS-1的表达无明显变化,但存在IRS-1酪氨酸磷酸化程度增加,并与手术病理分期高、细胞分化不良、深肌层浸润及盆腔淋巴结转移等不良的临床病理特征相关.
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维甲酸对人子宫颈癌细胞系HeLa细胞间隙连接蛋白转导途径调控作用的研究
目的 探讨维甲酸对人子宫颈癌细胞系HeLa 细胞间隙连接蛋白（Cx）43信号转导途径的调控作用。方法 应用特异性钙指示剂（Fluo-3 AM）在激光扫描共聚焦显微镜下动态观察维甲酸作用后的细胞质内信号转导分子游离钙的分布及强度变化。采用流式细胞仪、结合蛋白印迹技术分析，检测外源信号分子对Cx43的表达以及蛋白酪氨酸磷酸化状态的影响。结果 HeLa细胞内游离钙经维甲酸作用后明显超载，细胞内游离钙浓度（［Ca2+］i） 由静息状态下的35.73 μmol/L上升至58.16 μmol/L。流式细胞仪分析，Cx43阳性细胞表达率由1.9%上升至26.3%。蛋白印迹技术分析，HeLa细胞出现Cx43酪氨酸磷酸化。结论 维甲酸对HeLa细胞Cx43信号转导途径的调控是在细胞质内游离钙的参与下，使Cx43阳性细胞表达率上升，并在酪氨酸位点出现明显的磷酸化作用下实现的。
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胰岛素受体底物1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度与多囊卵巢综合征发病的关系
目的研究多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者脂肪组织胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)蛋白的表达及其酪氨酸磷酸化程度,探讨PCOS患者产生胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)的分子生物学机制.方法采用放射免疫法检测PCOS伴IR者19例(A组)、PCOS无IR者10例(B组)及单纯子宫肌瘤患者15例(对照组)的血清黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)及睾酮的水平;采用放射免疫法测定各组空腹血清胰岛素(fasting insulin, FIN)水平;采用葡萄糖氧化酶法测定各组空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)水平;采用稳态模型(homeostasis model assessment, HOMA)计算IR指数(即HOMA IR);采用蛋白印迹法检测IRS-1蛋白表达水平,同时应用免疫沉淀方法检测IRS-1的酪氨酸磷酸化程度.结果 (1)A组患者血清LH、LH/FSH、睾酮、FIN及HOMA IR分别为(15.8±2.8) U/L、2.8±0.6、(4.3±0.9) nmol/L、(25.2±3.8) mU/L、1.56±0.25; 均显著高于B组的(13.9±1.9) U/L、2.3±0.4、(3.6±0.4) nmol/L、 (13.4±3.8) mU/L、 0.87±0.28及对照组的(7.3±2.1) U/L 、1.3±0.3、(0.9±0.2) nmol/L、(9.5±2.6) mU/L、0.50±0.30,差异均有显著性(P<0.05);B组患者血清LH、LH/FSH、睾酮、FIN及HOMA IR也显著高于对照组(P<0.05);(2)IRS-1蛋白表达量及其酪氨酸磷酸化程度比较,A组均明显低于B组及对照组(3组IRS-1蛋白表达量分别为690±19、892±31、988±29, P<0.05;3组IRS-1酪氨酸磷酸化分别为528±72, 801±64, 1139±124,P<0.01);(3)A、B组HOME IR与IRS-1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度呈显著负相关(A组分别为r=-0.52, P<0.05; r=-0.61, P<0.01.B组分别为r=-0.60, P<0.05;r=-0.63, P<0.05).结论 PCOS患者脂肪组织IRS-1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度异常所导致的受体后信号转导障碍,可能是其产生IR的机制之一.
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多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗患者脂肪组织胰岛素受体底物2蛋白的表达及酪氨酸磷酸化的研究
目的检测多囊卵巢综合征(PCOS)患者脂肪组织胰岛素受体底物(IRS)2 蛋白表达及其酪氨酸磷酸化的程度,探讨发生PCOS合并胰岛素抵抗(IR)的机制.方法采用蛋白印迹(Western blot)法,检测PCOS合并IR患者19例(PCOS合并IR组)、PCOS非IR患者17例(PCOS非IR组)及因单纯子宫肌瘤行子宫切除术的患者20例(对照组)的IRS-2蛋白的表达;并采用免疫组化技术,检测 IRS-2在脂肪组织中的分布;采用免疫沉淀及增强化学发光法,检测IRS-2的酪氨酸磷酸化程度.结果 (1) PCOS 合并IR组、PCOS 非IR组及对照组IRS-2蛋白表达分别为1.15±0.26、1.13±0.26 及1.00±0.25,3组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)PCOS 合并IR组、PCOS 非IR组及对照组 IRS-2蛋白酪氨酸磷酸化程度分别为0.77±0.16、0.91±0.25及1.00±0.12,3组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);PCOS 非IR组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论PCOS合并IR患者脂肪组织的IRS-2蛋白酪氨酸磷酸化程度的降低,可能是发生IR的机制之一.
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脂肪组织中胰岛素受体底物1蛋白的表达及酪氨酸磷酸化在多囊卵巢综合征发病中的作用
目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者脂肪组织胰岛素受体底物1(IRS-1)的蛋白表达及酪氨酸磷酸化在PCOS发病中的作用.方法采用免疫沉淀法、Western印迹法和增强化学发光蛋白免疫印迹法及图像分析半定量检测24例PCOS患者[PCOS组,根据体重指数分为肥胖(体重指数≥24 kg/m2)和非肥胖(体重指数<24 kg/m2)者各12例]及同期因卵巢囊肿或输卵管阻塞行开腹手术的非PCOS患者24例(对照组,根据体重指数分为肥胖和非肥胖者各12例)的脂肪组织中IRS-1的蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度.结果 PCOS组肥胖者IRS-1的蛋白表达为(82±15)%,PCOS组非肥胖者为(79±18)%;对照组肥胖者为(75±19)%,对照组非肥胖者为(70±19)%,各组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).脂肪组织中IRS-1的酪氨酸磷酸化程度在PCOS组肥胖者为(52±23)%,对照组非肥胖者为(88±12)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);对照组肥胖者为(45±22)%,PCOS组非肥胖者为(70±25)%,与对照组非肥胖者比较,明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05);PCOS组肥胖者和对照组肥胖者间以及PCOS组肥胖者和PCOS组非肥胖者间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 PCOS组脂肪组织IRS-1的蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度明显减弱,可能参与胰岛素受体后信号传导抑制,并与PCOS胰岛素抵抗的发生有关.
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间隙连接蛋白43的磷酸化调节在卵巢上皮性癌化疗耐药中的作用
目的 通过检测卵巢上皮性癌(卵巢癌)间隙连接蛋白43(Cx43)、非磷酸化Cx43及蛋白激酶C(PKC)的表达,探讨Cx43的磷酸化调节在卵巢癌化疗耐药中的作用.方法 采用免疫组化法检测29例化疗敏感(化疗敏感组)和28例化疗耐药(化疗耐药组)卵巢癌患者癌组织中以及PKC抑制剂--星孢菌素处理后的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP细胞中Cx43、非磷酸化Cx43及PKC蛋白的表达,并采用三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤药敏实验(ATP-TCA)检测SKOV3/DDP细胞对化疗药物的敏感性.结果 (1)免疫组化法检测显示,化疗耐药组Cx43和非磷酸化Cx43蛋白的阳性表达率(分别为54%和14%)明显低于化疗敏感组(分别为83%和59%,P<0.05);化疗耐药组PKC蛋白的阳性表达率明显高于化疗敏感组(分别为64%和31%,P<0.05).卵巢癌组织中,PKC蛋白的阳性表达率与Cx43、非磷酸化Cx43蛋白的阳性表达率呈明显负相关关系(r=-0.626和-0.714,P<0.05).(2)免疫组化法检测显示,星孢菌素处理后SKOV3/DDP细胞中PKC蛋白的表达强度减弱,Cx43及非磷酸化Cx43蛋白的表达强度增强,随着星孢菌素处理时间的延长,Cx43蛋白的表达强度进一步增强.(3)ATP-TCA检测显示,体外培养的SKOV3/DDP细胞对紫杉醇和顺铂均耐药;紫杉醇和顺铂分别联合星孢菌素处理后细胞敏感度增加,其中联合低浓度(1×10-8 mol/L)星孢菌素者为中度敏感.联合高浓度(1×10-7 moL/L)星孢菌素者为高度敏感.结论 PKC通过对Cx43的磷酸化作用导致Cx43蛋白的表达下降,降低卵巢癌对化疗药物的敏感性,这种效应可以被星孢菌素逆转.
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双氢青蒿素对卵巢上皮性癌细胞体外增殖及有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化水平的影响
目的 探讨双氢青蒿素对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞体外增殖的影响,以及对卵巢癌细胞有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸化水平的影响.方法 双氢青蒿素处理卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3细胞后,四甲基偶氮唑蓝比色法检测SKOV3和OVCAR3细胞的体外增殖抑制效应,蛋白印迹法检测SKOV3和OVCAR3细胞中两种MAPK[即细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和p38蛋白激酶]的磷酸化水平,以未用双氢青蒿素处理的SKOV3和OVCAR3细胞作为对照.结果 双氢青蒿素处理72 h后,SKOV3和OVCAR3细胞的50%抑制浓度(IC50)平均分别为(9.0±1.4)和(5.5±1.2)μmol/L.双氢青蒿素处理后,SKOV3和OVCAR3细胞中ERK 1/2的磷酸化水平明显降低,相对于对照细胞分别下降了64.2%和75.3%,差异均有统计学意义(P＜0.05);而p38蛋白激酶的磷酸化水平无明显变化,相对于对照细胞仅分别下降了8.5%和6.4%,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 双氢青蒿素能制卵巢癌细胞的体外增殖,该作用可能与其下调癌细胞内ERK 1/2的磷酸化水平有关.
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盘状结构域受体1促进微管相关蛋白Tau磷酸化在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用
目的 研究盘状结构域受体1(discoidin domain receptor 1,DDR1)调控微管相关蛋白Tau(简称Tau蛋白)表达及其磷酸化在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中的作用及其机制.方法 将64只7日龄无特定病原体级雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组)、HIBD组、生理盐水(normal saline,NS)治疗组(HIBD+NS组)及DDR1抑制剂(DDR1 inhibitor,DI)治疗组(HIBD+DI组),每组16只.通过结扎左侧颈动脉后置于低氧箱内2 h,复制新生大鼠HIBD模型.HIBD+DI组造模后,立即给予DDR1抑制剂侧脑室注射治疗.造模后48 h收集左侧皮层组织,HE染色观察大脑皮层的组织病理学改变;蛋白质印迹法检测皮层组织中DDR1及Tau蛋白的磷酸化水平;酶联免疫吸附试剂盒法检测乙酰胆碱含量.用方差分析和t检验对数据进行统计学分析.结果 (1)皮层损伤情况:与Sham组相比,HIBD组异常神经元所占比例明显增多[(80.28±4.51)%与(10.40±2.17)%,t=39.491,P<0.01].HIBD+DI组动物大脑皮质区核固缩及坏死细胞比例较和HIBD+NS组显著降低[(31.91±3.05)%和(82.01±7.20)%,t=18.123,P<0.01)].(2)DDR1和Tau蛋白磷酸化水平比较:DDR1磷酸化水平方面,HIBD组高于Sham组(0.922±0.199与0.095±0.023,t=10.379,P<0.01),HIBD+NS组高于HIBD+DI组(1.200±0.171与0.255±0.111,t=11.901,P<0.01).Tau磷酸化方面也显示相似的趋势(HIBD组和Sham组分别为,0.194±0.224与0.919±0.228,t=7.347;HIBD+DI组和HIBD+NS组分别为1.100±0.167与0.291±0.210,t=9.447,P值均<0.01).(3)乙酰胆碱含量:HIBD组低于Sham组[(3.685±0.472)与(7.429±0.861)ng/g蛋白,t=10.781,P<0.01].而HIBD+DI组高于HIBD+NS组[(7.058±0.915)与(2.521±0.723)ng/g蛋白,t=10.989,P<0.01].结论 DDR1激活引起HIBD新生大鼠皮层组织中Tau过度磷酸化,进而导致神经递质乙酰胆碱释放减少.抑制DDR1活化能够降低HIBD新生鼠皮层组织中Tau的磷酸化水平,增加乙酰胆碱的释放.DDR1抑制剂对HIBD新生鼠脑损伤具有保护作用.
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构建并利用绒毛外滋养细胞组织芯片检测磷酸化信号转导和转录活化因子3在子痫前期患者的表达
目的 构建子痫前期患者绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast,EVCT)组织芯片,并利用该组织芯片检测磷酸化信号转导和转录活化因子3 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,pStat3)在子痫前期EVCT中的表达水平,探讨Stat3信号途径在子痫前期病理过程中的作用. 方法 收集2007年12月12日至2010年12月31日郑州大学第三附属医院80例子痫前期和58例正常妊娠孕妇的胎盘组织用来构建组织芯片,利用波形蛋白、细胞角蛋白和人类白细胞抗原-G抗体进行免疫组织化学染色验证EVCT组织芯片,采用免疫组织化学半定量方法检测pStat3在子痫前期和正常妊娠孕妇胎盘EVCT组织的表达情况.采用非参数秩和检验、Kruskai-Wallis H检验、t检验和卡方检验进行统计分析. 结果 57例子痫前期(109个组织点)和31例正常妊娠孕妇的胎盘块(65个组织点)适于EVCT组织芯片的构建.组织芯片中EVCT细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性,人类白细胞抗原-G染色阳性,符合EVCT的特点,86.4％ (76/88)的样本保留了EVCT,组织芯片构建成功.子痫前期患者胎盘EVCT中pStat3阳性率为51.1％(24/47),重度子痫前期组阳性率为52.3％(23/44),早发型子痫前期组阳性率为50.0％(19/38),均显著低于正常妊娠组的72.4％ (21/29),差异均有统计学意义(U分别为492.00、473.00和401.00,P均＜0.05). 结论 EVCT组织芯片构建成功,利用该芯片可高通量检测pStat3的表达情况.pStat3信号转导途径可能参与了早发型和重度子痫前期的发生发展.
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钙蛋白酶-细胞周期依赖性蛋白激酶5通路参与β淀粉样蛋白25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化
目的 探讨凝聚态β淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)对胎鼠皮质神经元中性钙蛋白酶-细胞周期依赖性蛋白激酶5(calpain-CDK5)通路的影响及其对tau蛋白的过度磷酸化和骨架稳定性的影响.方法 用荧光酶标仪测定荧光强度来反映calpain活性;用Western-blot和(或)免疫细胞化学检测CDK5的激活蛋白p25/p35的蛋白水平和tau蛋白Thr205/Ser404位点磷酸化情况来体现CDK5活性;用电镜技术观察微管结构的变化来显示细胞骨架的改变情况.结果 20μmol/L的凝聚态Aβ25-35作用于皮质神经元12 h后,检测反映calpain活性的荧光强度(每微克蛋白荧光强度)高达680.25±37.77,与空白对照组167.25±11.67相比,差异有统计学意义(P＜0.05);对CDK5有活化作用的p25蛋白水平比空白对照组升高(2.07±0.20)倍,差异也有统计学意义(P＜0.05);CDK5的作用底物tau蛋白Thr205和Ser404位点磷酸化程度也显著增加,分别比空白对照组升高(1.80±0.27)和(1.83±0.14)倍,差异均有统计学意义(P＜0.05);同时出现神经元微管骨架排列紊乱.结论 凝聚态Aβ25-35通过活化皮质神经元的calpain,使p35降解p25来激活CDK5,促使tau蛋白过度磷酸化,破坏了微管骨架的稳定性.
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帕金森病运动并发症与谷氨酸受体亚型GluR1Ser845磷酸化关系的实验研究
目的 探讨帕金森病(PD)长期左旋多巴治疗的运动并发症与纹状体神经元谷氨酸受体1的845位丝氨酸(GluR1Ser845)磷酸化的关系.方法 通过6-羟基多巴立体定向注射至大鼠前脑内侧前脑束建立PD动物模型,然后左旋多巴甲酯腹腔注射治疗(25 mg·kg-1·d-1,每天2次)22 d,评估旋转时间、关期发生频率情况;采用免疫荧光与蛋白印迹法检测纹状体区谷氨酸受体1(GluR1)亚细胞分布及GluR1Ser845磷酸化的表达情况.结果 PD大鼠长期应用左旋多巴处理后呈现旋转时间逐渐缩短、关期频率递增的趋势,与人类症状波动和开关现象具有相似特征.PD大鼠损伤侧纹状体细胞膜上GluR1和GluR1Ser845磷酸化的数量分别减少至73.0%±4.8%和42.0%±5.6%;长期左旋多巴处理后使损伤侧纹状体细胞膜上GluR1和GluR1Ser845磷酸化的数量分别增加至104.0%±5.5%和112.0%±3.4%;然而损伤侧纹状体GluR1总蛋白数量未发生明显变化.这些改变特异性发生在小清蛋白阳性的中间神经元上.结论 长期左旋多巴治疗的运动并发症可能与小清蛋白阳性的神经元上GluR1的亚细胞分布及GluR1Ser845磷酸化的改变有关.
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抑制磷酸酶和tau过度磷酸化诱导神经细胞凋亡
目的探讨磷酸酶活性抑制、tau蛋白异常磷酸化与神经细胞变性死亡的关系.方法磷酸酶(PP)-2A/PP-1抑制剂岗田酸(okadaic acid,OA)10 nmol/L与成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)共培养,DNA-梯带和末端转移酶标记技术.结果用10 nmol/L OA与SY5Y细胞共培养24 h和48 h均可引起DNA-梯带出现,此时末端转移酶标记显示阳性细胞数由2.16%±0.94%分别增多至18.05%±3.57%(P＜0.01)和22.52%±4.78%(P＜0.01).结论由于上述检测指标均与细胞凋亡有关,提示抑制PP-2A和部分抑制PP-1引起tau蛋白异常磷酸化可能通过神经细胞凋亡而引起AD患者神经细胞丢失.
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Aβ25-35注射诱导大鼠海马神经元tau蛋白异常磷酸化
目的观察大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ25-35后,神经元ser199/ser202、ser396、thr231等位点tau蛋白磷酸化的水平以及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活性变化,探讨Aβ25- 35与tau蛋白异常磷酸化的关系及机制.方法应用脑立体定向技术给成年大鼠海马背侧注射凝聚态Aβ25-35 5 nmol,术后14 d,采用镀银染色方法观察海马组织神经元病理改变,免疫组织化学染色方法和免疫蛋白印迹技术观察大鼠海马 tau [pS396]、 tau [pSpS199/202]、 tau [pT231]的表达水平,免疫蛋白印迹技术检测海马GSK-3β和磷酸化GSK-3β的水平变化.结果凝聚态Aβ25-35组神经元纤维走行紊乱、增粗、肿胀,密集成宽带状,轴突深染.海马神经元tau [pS396]、 tau [pSpS199/202]、 tau [pT231]的阳性表达数(分别为38.2±5.9,107.6±8.4,78.4±3.7)明显高于正常组和生理盐水组(P<0.01) ,GSK-3β和磷酸化GSK-3β的水平亦明显高于正常组和生理盐水组.结论海马背侧注射Aβ25-35可通过激活GSK-3β诱导tau蛋白发生异常磷酸化.
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叶酸和维生素B12对老年大鼠海马中tau蛋白磷酸化的影响
目的 研究叶酸和维生素B12与tau蛋白磷酸化的关系,及叶酸和维生素B12在阿尔茨海默病(Alzheimer disease's,AD)的发病机制中的可能作用.方法 用免疫印迹和免疫组织化学的方法观察和比较2个月龄和40个月龄大鼠海马中tau蛋白的磷酸化情况,以及用叶酸和维生素B12处理后的40个月龄大鼠海马中tau蛋白的磷酸化水平.结果 发现40个月龄老年大鼠脑中tau蛋白Ser396/404位点磷酸化水平比2个月龄大鼠高97%.同时发现用叶酸和维生素B12处理后,40个月龄大鼠海马中tau蛋白Ser396/404位点的过度磷酸化水平降低了27%.结论 叶酸和维生素B12对神经骨架蛋白tau有一定的保护作用.
