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女性生殖道癌前病变的研究进展及新观点
肿瘤的形成过程就是恶性的单克隆细胞通过选择达到稳定及增长的过程,在形态学上也会显现出异常的增生.在这一过程中,遗传学上的单克隆选择与形态学上的不典型增生的关系,在不同肿瘤中是有差异的.
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甲型流感病毒核蛋白基因的克隆表达及纯化
目的将甲型流感病毒核蛋白(NP)基因克隆到原核表达载体进行可溶性融合表达,制备纯化的病毒核蛋白,为制备甲型流感病毒单克隆抗体提供材料.方法提取甲型流感病毒RNA,设计引物,RT-PCR扩增NP基因,利用基因工程的手段,将甲型流感病毒的NP基因在大肠埃希菌中进行融合表达,并将表达产物进行亲和层析.结果成功构建了甲型流感病毒NP基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物.结论通过合理控制发酵时间、生长温度和诱导物浓度,制备了较为理想的可溶性甲型流感病毒核蛋白.
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肿瘤抑制蛋白 FBW7在口腔鳞状细胞癌中表达的研究
目的检查肿瘤抑制蛋白FBW7在鳞状细胞癌（ OSCC）中的表达，初步探究FBW7表达与OS-CC细胞克隆形成能力的关系。方法收集19例OSCC患者的癌巢组织及对应癌旁组织，应用免疫组化染色与Real time RT-PCR技术检测FBW7在癌巢及对应癌旁组织中的表达情况。 Western blot 和Real time RT-PCR技术比较口腔鳞状细胞癌细胞系KV、CTST-1、CTST-2以及正常颊黏膜上皮细胞中FBW7蛋白和mRNA表达水平，分析FBW7表达与口腔鳞状细胞癌细胞系克隆形成能力的关系。结果免疫组化和Real time RT-PCR结果显示，FBW7蛋白及mRNA在对应癌旁组织中的表达水平明显高于癌巢组织（P＜0.05），West-ern blot及Real time RT-PCR结果显示，FBW7蛋白和mRNA在口腔鳞癌细胞系中的表达水平明显低于正常口腔黏膜上皮细胞（ P＜0.05）。克隆形成实验结果表明， FBW7表达较高的舌癌细胞株的克隆形成数目较少，克隆形成能力较弱。结论 FBW7在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中表达显著降低，与口腔癌细胞系的克隆形成能力呈负相关。
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血流感染MRSA中的ST239克隆株快速检测与分析
目的 评价多重PCR法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) ST239克隆株的快速检测及合肥地区血流感染MRSA的分子流行现状.方法 收集2008年至2013年安徽医科大学第一附属医院及第二附属医院临床分离的血流感染金黄色葡萄球菌的106株MRSA进行相关耐药性分析,并采用多重PCR技术对ST239型克隆株进行快速检测,同时运用多位点序列分型(MLST)加以确认及葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)分型分析.结果 106株血流感染金黄色葡萄球菌中MRSA有51株,占48.1％,MRSA均为多耐药菌,对红霉素、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),MRSA和MSSA对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的敏感率分别为86.3％和 94.5％;51株MRSA中有47株为ST239快速检测阳性,阳性率高达92.2％;随机选取20株ST239初筛阳性的MRSA经MLST验证和SCCmec分型后确认为MRSA-ST239-SCCmecⅢ型.结论 合肥地区血流感染MRSA近半数为多重耐药克隆MRSA-ST239-SCCmecⅢ型,运用多重PCR技术能够快速检测ST239克隆株.
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基因扫描在初诊急性淋巴细胞白血病患儿Ig/TCR基因重排克隆性分析中的应用
目的 探讨基因扫描技术在初诊急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿Ig/TCR基因重排克隆性分析中的作用,并探讨Ig/TCR基因重排的类型及其克隆性与ALL临床特征之问的关系.方法 本研究为临床实验研究.选取2009年3月至201 1年3月广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科确诊和治疗的ALL患儿86例,所有病例均经骨髓细胞形态学和流式细胞术免疫分型诊断.采用多重PCR方法检测初诊ALL患儿的4种Ig/TCR基因重排(IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ),采用基因扫描技术对上述基因重排进行克隆特性分析.采用x2检验比较ALL患者主要临床特征在单克隆及寡克隆lg/TCR基因重排之间的差异.结果 86例初诊ALL患儿中,83例(96.5％)可检出 1种或1种以上Ig/TCR基因重排,平均每例可检出2.52个Ig/TCR基因重排；61例进行基因扫描的患儿中,56例(91.8％)可检出1种或1种以上单克隆性Ig/TCR基因重排；172个Ig/TCR基因重排中,IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ的比例分别为27.9％、27.9％、19.8％和24.4％.单克隆、寡克隆及多克隆性的构成比分别为58.1％、30.8％和11.1％,以单克隆性重排为主.4种Ig/TCR基因重排类型的单克隆性及寡克隆性在不同临床特征间差异无统计学意义(P值均＞ 0.05).结论 基因扫描可简便、快捷地分析Ig/TGR基因重排的克隆性,从而可选择其中单克隆或寡克隆者作为微小残留白血病(MRD)追踪的靶目标；ALL患儿的临床特征与Ig/TCR基因重排的类型及其克隆性无关.
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人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础.方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列.将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR).随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescript Ⅱ KS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上.后采用KpnI和NotⅠ从pBluescript Ⅱ KS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnI/NotI酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahFR).对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认.结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确.结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础.
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丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
目的:探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.方法:应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCRluc)转染的抑制作用.结果:G418 筛选能使 Rz213 在转染细胞内有效表达 RzRNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.结论:我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
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bcl-2反义寡核苷酸体外净化急性髓细胞白血病骨髓的研究
有效地体外净化自体造血干细胞移植(AHSCT)的移植物是减少移植后复发及提高疗效的重要手段,当前研究的净化方法还存在一些局限性,或不能彻底清除恶性克隆细胞,或对正常细胞有毒性作用,影响造血功能恢复.
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自体外周血造血干细胞移植在儿童神经母细胞瘤中的应用
神经母细胞瘤（Nueroblastoma，NB ）是儿童常见的外周神经来源的恶性肿瘤，约占儿童恶性肿瘤的7％～10％［1］。根据INSS分期标准NB临床分期分为1～4期以及特殊4S期，4期恶性程度高、预后差。Mauricio A 等［2］2006年报道153例 IV期NB长期生存率仅为34％。目前骨髓移植或自体外周血干细胞移植（autologous peripheral blood stem cell transplantation，APBSCT）对于治疗儿童Ⅳ期NB具有一定的临床疗效［3］。APBSCT是经大剂量放化疗预处理，清除受体体内的肿瘤细胞及异常克隆细胞，阻断发病机制，然后移植入自体造血干细胞，使其重建正常造血免疫，而达到治疗目的的一种治疗手段。So Young Yoo 等［4］2013年报道90例高危NB患儿中因复发、进展、死亡等因素73例按计划行APBSCT治疗，15例移植后复发或进展，7例死亡，58例获随访，总生存率为65％（38／58），总无事件生存42．2％（38／90），因此APBSCT治疗高危NB具有积极的意义。虽然20世纪80年代末以来， APBSCT已逐渐为人们所接受及熟悉，但对于低质体重儿的移植安全、C D34是否分选纯化、骨髓净化、二次移植的意义等仍是目前临床关注的热点。本文将就上述问题作初步的阐述。
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人喉癌Hep-2细胞株CD133+肿瘤干细胞生物学特性研究
目的 研究喉癌Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞的干细胞特性及其生物学特性.方法 流式细胞仪分选Hep-2细胞株中CD133+肿瘤细胞,Transwell法检测CD133+肿瘤细胞侵袭能力及三代克隆形成能力；CD133+肿瘤细胞与紫杉醇共培养,10 Gy的直线加速器照射CD133+肿瘤细胞,四甲基偶氮唑蓝法计算其相对存活率和生长抑制率,观察其放化疗抵抗性.结果 CD133+细胞比例为3.1％±0.2％,流式细胞仪分选纯度可达90.2％±5.5％,分选后的CD133+细胞贴壁,呈团块状、克隆球状生长.增殖速度明显较CD133-细胞快；Transwell实验中,相同视野CD133+细胞穿膜细胞数(526±39)个/每视野,而CD133-细胞为(220±20)个/每视野,二者差异有统计学意义(t=22.08,P＜0.01)；CD133+细胞三代克隆形成率分别为30.0％±4.7％、32.2％±3.6％、32.7％±3.4％,CD133-细胞三代克隆形成率分别为15.2％±2.2％、12.0％±2.5％、13.8％±3.3％,同代比较差异有统计学意义(t值分别为8.99、14.66、12.69,P值均＜0.01).在紫杉醇共培养体系中,CD133+细胞24 h、48 h、72 h的相对存活率分别为90.1％±5.9％、85.1％±7.1％、70.3％±6.4％,均高于同时期对照组CD133-细胞(t值分别为5.24、8.18、8.14,P值均＜0.01)；放射线照射后,CD133+细胞生长抑制率30.0％±7.1％,显著低于CD133-细胞的55.0％±6.3％(t=8.30,P＜0.01).结论 CD133+ Hep-2细胞所占比例较小,具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力,对放化疗有抵抗性,具有干细胞特性.靶向CD133+肿瘤细胞,有望有效杀伤喉癌干细胞.
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大鼠颊黏膜鳞状细胞癌单克隆细胞系Rca-B的建立及其生物学特性研究
目的 建立大鼠颊黏膜鳞癌单克隆细胞系,并观察其生物学特性,为口腔癌的研究提供大鼠来源的恶性肿瘤细胞系、移植瘤和转移动物模型.方法 将4-硝基喹啉-1-氧化物诱发的SD大鼠颊黏膜鳞癌组织标本进行体外传代培养,利用有限稀释法获得单克隆细胞.光学和电子显微镜观察该细胞的形态变化,细胞计数和四唑盐比色法观察细胞的增殖能力,染色体分析确定细胞核型特点,流式细胞仪检测其细胞周期;动物实验观察细胞裸鼠皮下接种成瘤率及实验性肺转移能力.结果成功得到单克隆细胞系,细胞形态和生物学观察结果表明,该细胞系符合鳞癌细胞的基本特征,65代细胞群体倍增时间为25.44 h,平板克隆形成率为56.30%.细胞周期分布S期占20.13%;染色体为四倍体核型.角质蛋白和波形蛋白免疫组织化学染色均为阳性.细胞系裸鼠皮下接种成瘤为16/16;细胞系行裸鼠尾静脉注射后,其实验性肺转移为10/10;该单克隆细胞系SD大鼠同种异体皮下接种不能成瘤.结论 成功建立SD大鼠颊黏膜鳞癌细胞系Rca-B,细胞系具有高转移鳞癌细胞的典型生物学特征;该细胞系是研究口腔鳞癌分子发生机制和防治策略的又一理想模型.
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人UROC28基因真核表达载体的构建
目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达.方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因.重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况.结果: PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28, 经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致.证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3中.Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞 24 h 后有UROC28的表达.结论:成功构建了pcDNA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达.
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神经干细胞研究进展及临床应用前景
传统观点认为,中枢神经系统的神经细胞是一种终末细胞,即细胞处于有丝分裂后状态,缺乏再生能力.创伤和病理过程引起的神经元丢失是一个不可逆的过程.近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)研究的迅猛发展使这一概念面临重大修正,并为中枢神经系统疾病的治疗开辟了一块广阔的新天地.
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克隆细胞株S2D9建立的肿瘤动物模型基本特性研究
目的研究从S180获得的克隆细胞株S2D9,接种4个不同品(种)系小鼠建立肿瘤动物模型的某些基本生物学特性.方法由KM小鼠腹腔传代的S2D9克隆细胞,用GKN稀释成不同浓度,接种KM、DBA/2、615、C57BL/6小鼠右腋皮下及腹腔,观察小鼠早出现可见肿块、腹水时间及小鼠生存时间;不同品(种)系小鼠经皮下接种S2D9细胞,建立肿瘤模型,从接种后第5日,每日观察肿瘤生长情况,测量肿块直径(cm),绘制肿瘤生长曲线;S2D9克隆细胞株接种BALB/c小鼠皮下,取接种第7日肿块,经石蜡切片,HE染色,观察病理结果;不同品(种)系小鼠皮下接种S2D9瘤细胞建立的动物模型,经腹腔注射环磷酰胺(CTX)或顺胺氯铂,观察S2D9克隆细胞肿瘤模型对CTX或顺胺氯铂治疗的敏感性.结果 S2D9克隆细胞在615及DBA/2小鼠的皮下较KM及C57BL/6小鼠容易生长肿瘤;在KM及DBA/2小鼠腹腔较C57BL/6及615小鼠容易长出腹水;皮下接种KM、C57BL/6、615及DBA/2 四个不同品(种)系小鼠,第12天瘤重分别为(2.3±0.9)g,(0.8±0.2)g,(2.0±0.2)g及(1.9±0.1)g;S2D9瘤细胞接种4个不同品(种)系小鼠制备的肿瘤模型,用CTX治疗,抑瘤率分别为80%(615),75%(C57BL/6),68.4%(DBA/2),65.2%(KM);用顺胺氯铂治疗的抑瘤率分别为75%(615),73.6%(DBA/2),62.5%(C57BL/6),65.2%(KM).可见S2D9细胞与615小鼠建立的模型对CTX或顺胺氯铂治疗敏感.结论 S2D9克隆细胞仍具有较强致瘤性,但在细胞均一性、接种小鼠生长肿瘤一致性方面比原代细胞好,对化疗反应更敏感,克隆细胞易于进行质量控制,因而推广使用后,有利于肿瘤动物模型复制的一致性和可重复性.
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小鼠肝癌H22细胞克隆株的选择及其细胞特性比较
目的对武汉大学典型培养物保藏中心保存的小鼠肝癌H 22细胞(武汉H 22)进行克隆培养,并研究克隆细胞的特性.方法用有限稀释法对武汉H22细胞进行克隆,从中筛出12株细胞.应用SDS-PAGE电泳、流式细胞仪、免疫组化等方法,对它们的染色体数目、DNA含量、蛋白质分布、镜下细胞面积等方面,进行了比较.结果 12株克隆细胞染色体数目为41～45条;DNA含量、蛋白质分布比原瘤株更加集中;H2E10克隆株的镜下细胞面积与其他瘤株显著不同.结论 H22细胞克隆株之间的某些细胞特性不同,但保持了原瘤株的基本特性,且其染色体、蛋白质分布比原瘤株更加集中.
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转基因克隆猪与人类异种器官移植
利用猪的器官来解决当前人源器官严重短缺,为解决移植器官短缺的可行的途径,直接并准确地对α-1,3半乳糖苷转移酶(α-l,3GT)基因进行同源重组,使α-1,3GT失活,再结合猪体细胞克隆技术,对其进行人源化改造,减弱或消除排异反应.然而,猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)为异种器官移植的主要障碍.因此,既要剔除导致人类排异反应的排斥基因,又要确保猪器官异种移植的安全性.
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骨髓增生异常综合征异常克隆起源的研究
目的研究骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)异常克隆的细胞起源.方法应用识别髓系细胞的CD33单抗、B细胞的CD19单抗和T细胞的CD2单抗的免疫磁珠分别分选10例有染色体异常的MDS患者(其中三体8 5例, 三体8合并三体9 1例,三体8合并7p- 1例,20q- 2例,t(1;7) 1例)骨髓中的CD2+、CD19+和CD33+细胞,随后分别采用1、7、8号染色体着丝粒探针和20q12序列特异性探针对上述细胞进行间期荧光原位杂交检测,每类细胞均计数200～300个.结果三体8、t(1;7)易位和20q-染色体异常均累及CD33+细胞, 而CD2+细胞均未被累及; 1例20q-还累及CD19+细胞.结论 MDS的染色体畸变主要累及髓系,但在少数MDS可累及B淋巴细胞,提示异常克隆起源于多能干细胞阶段.
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瑞香狼毒水提物小鼠药物血清对小鼠白血病L1210细胞增殖、克隆形成和DNA合成的影响
目的从整体水平探讨瑞香狼毒水提物(SCLA)的抗癌作用及机制.方法以不同剂量SCLA ig给药后,不同时间采集小鼠血清,处理体外培养的小鼠白血病L1210.细胞,观察肿瘤细胞MTT还原,克隆形成能力和DNA合成的改变.结果SCLA 3,6,12 g/kg给药1,2,4,8 h后的药物血清处理肿瘤细胞后,其MTT还原及克隆形成率均显著降低;给药2 h时的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用.SCLA小鼠药物血清也显著抑制[3H]TdR掺入L1210细胞DNA.结论直接抑制癌细胞增殖及DNA合成是瑞香狼毒的重要抗癌机制.
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L-赖氨酸对克隆的胰岛β细胞株INS-1E细胞的急性作用
目的:探讨L-赖氨酸刺激INS-1E细胞分泌胰岛素(INS)的作用.方法:INS-1E细胞经传代培养2d后,在Krebs-Ringer缓冲液中37℃培养箱预培养30 min,再用含有不同浓度葡萄糖和不同浓度L-赖氨酸的改良Krebs-Ringer缓冲液培养60min,然后留取上清液进行胰岛素测定并用细胞蛋白含量校正胰岛素.结果:在1.1～6.7mmol/L葡萄糖范围内,随着葡萄糖浓度的增加,INS分泌量逐渐增加.L-赖氨酸在0.1～20mmol/L范围促进了葡萄糖刺激的INS-1E细胞的胰岛素分泌,随剂量增大而增强.结论:INS-1E细胞分泌胰岛素随葡萄糖浓度的增加而增加.L-赖氨酸能增加葡萄糖诱导的INS-1E细胞分泌胰岛素的作用.
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人脂肪间充质干细胞的致瘤性研究
目的 研究人脂肪间充质干细胞是否具有致瘤性,为其临床应用提供安全性依据.方法 96只裸鼠分为空白对照组、阳性对照组和脂肪间充质干细胞组,每组32只,雌雄各半.将传代第5代的人脂肪间充质干细胞接种至裸鼠皮下,分别于注射后3d、1个月、3个月、6个月对动物进行解剖检查,观察其肿瘤形成情况；同时用软琼脂克隆形成实验观察人脂肪间充质干细胞形成集落的能力.结果 裸鼠体内致瘤实验中,脂肪间充质干细胞组和空白对照组动物大体解剖学观察和病理组织学检查均未见异常.软琼脂克隆形成实验显示人脂肪间充质干细胞未表现出在阻力介质中的克隆生长能力.结论 短期传代后的人脂肪间充质干细胞不具致瘤性,有一定安全性.
