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CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞原代细胞白血病体外净化效应
本研究旨在探讨免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞白血病(CML)原代白血病细胞的体外净化效应.培养并扩增PA317/iNOS细胞并用G418筛选;用MH3T3细胞测定病毒滴度,分离外周血单个核细胞并用抗CD3单克隆抗体激活;病毒感染靶细胞CD3AK及用G418筛选,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD3AK/iNOS中iNOS cDNA的转录;用硝酸还原酶法检测CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量以及iNOS活性;用系列稀释半定量巢式RT-PCR检测CML患者白血病原代细胞经CD3AK/iNOS细胞净化后bcr/abl融合基因的表达水平.结果表明,PA317/iNOS细胞能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒;MH3T3细胞测定病毒滴度为1.0×105CFU/ml;RT-PCR检测发现CD3AK/iNOS细胞中有iNOS cDNA的转录;CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量和iNOS活性较CD3AK细胞明显升高.上述两项指标,经统计学检验,均有显著性差异(P<0.001,P<0.001).系列稀释半定量RT-PCR检测发现,经CD3AK/iNOS细胞净化后CML患者白血病细胞bcr/abl融合基因的表达明显下调.实验结果统计分析表明,CD3AK/Neo细胞组净化后与CD3AK/iNOS细胞组净化后bcr/abl mRNA表达的比较具有显著性差异(P<0.001).结论:逆转录病毒可介导iNOS基因转入CD3AK细胞,成功地构建了CD3AK/iNOS;CD3AK/iNOS能明显地增加NO含量和iNOS活性,应用CD3AK/iNOS可能成为一个有效的AHSCT体外净化方法.
关键词: 慢性粒细胞白血病 CD3AK/iNOS细胞 CD3抗原 一氧化氮 体外净化 -
异体CD3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用
肿瘤生物治疗是近年来肿瘤治疗中的重要进展之一,有关免疫效应细胞在自体造血干细胞的体外净化中的应用也引起了国内外学者的兴趣.我们观察了CD3AK细胞对残留CML细胞系及原代白血病细胞的体外杀伤作用,以期CD3AK细胞应用于自体移植体外净化.
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bcl-2反义寡核苷酸体外净化急性髓细胞白血病骨髓的研究
有效地体外净化自体造血干细胞移植(AHSCT)的移植物是减少移植后复发及提高疗效的重要手段,当前研究的净化方法还存在一些局限性,或不能彻底清除恶性克隆细胞,或对正常细胞有毒性作用,影响造血功能恢复.
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bcl-2部分编码区的反义RNA促进烷化溶血磷脂诱导的白血病细胞凋亡
bcl-2抗凋亡基因在白血病细胞株常有高表达,引起对化放疗的耐受,封闭该基因的转录和翻译都将诱导白血病细胞凋亡,且对化放疗敏感.本研究通过比较逆转录病毒载体介导的全部和部分编码区的bcl-2反义基因瞬时和稳定表达在对抗bcl-2作用、降低内源性bcl-2蛋白水平和对烷化溶血磷脂ET 18-OCH3 (ALP)诱导白血病细胞凋亡的影响的差异,探讨了短片段bcl-2反义RNA作用特点,以期为硫代寡聚脱氧核苷酸的治疗白血病和对ALP协同体外净化白血病细胞提供实验基础.
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自体造血干细胞体外净化研究的新进展
高剂量化、放疗联合自体造血干细胞移植已广泛用于恶性肿瘤的治疗研究.
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癌光啉体外净化骨髓中残留白血病变后行自体骨髓移植治疗白血病
目的:为减少白血病患者自体骨髓移植后白血病复发率和提高长期无病存活率.方法:采用缓解期急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞在体外经处理后用癌光啉(浓度为10μg/ml)加光照净化,待患者完成预处理后回输给自身.结果:10例急性髓细胞白血病患者接受了本净化方法后移植治疗.净化后输入有核细胞中位数1.30(0.7~2.45)×108/kg,CD34+细胞中位数2.39(0.74~4.06)×106/kg,CFU-GM中位数1.44(0.32~4.65)×104/kg.10例中9例造血功能重建,WBC升到>1.0×109/L中位数时间20(15~43)d,>2.0×109/L中位数时间30(21~55)d,BPC>50×109/L中位数时间46(25~62)d.经中位26个(20~64)月随访,有6例仍无病存活;3例复发,其中2例复发后失去随访;1例嗜碱细胞性白血病经化疗再次取得缓解,至今CR2后又无复发存活14个月;1例死于与移植相关并发症.结论:初步结果表明,用癌光啉加光照净化自体骨髓中残留白血病细胞后行自体骨髓移植治疗白血病是一种安全而有潜力的方法.
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亲溶酶体剂IHW2对白血病骨髓净化作用的机制初探
对白血病缓解期患者实施自体骨髓移植后,残留白血病细胞会导致复发.因此采取不损伤正常造血干细胞的体外净化手段,清除骨髓中残留白血病细胞,特别是耐药细胞,是消除自体骨髓移植后急性白血病复发的关键.
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长期培养人急性髓系白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞的影响
目的:通过观察长期培养的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞体外的作用,寻求一种体外净化辅助方法.方法:实验于2002-04/2003-12在大连医科大学附属第二医院血液内科实验室完成.20例急性髓细胞白血病为初诊或复发病例.男11例,女9例,19~55岁,平均36.8岁,由大连医科大学附属第二医院血液内科、大连市友谊医院血液内科、铁路医院血液科、大连大学附属医院血液科提供.患者知情同意并签署知情同意书.诊断均符合张之南主编的"血液病诊断及疗效标准",其中M12例,M2 8例,M34例,M42例,M54例.常规分离培养人骨髓基质细胞,收集14,28,35 d的上清分别与早幼粒白血病细胞共孵育,以不加入急性髓细胞白血病基质上清液的早幼粒白血病细胞的培养体系作为阴性对照,通过形态、流式细胞术、DNA电泳来观察早幼粒白血病细胞有无分化及凋亡表现.结果:20例患者均进入结果分析.①急性髓细胞白血病骨髓基质细胞是由网状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞组成.②Wright-Giemsa染色可见阴性对照早幼粒白血病细胞为悬浮生长,胞体内含颗粒,增殖旺盛,镜下常见核分裂、增殖状态的早幼粒白血病细胞;14 d及28 d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞,形态未见明显变化,35 d培养的急性髓细胞白血病基质上清液作用的早幼粒白血病细胞出现细胞变形,细胞核出现改变,部分细胞核仁减少或消失.NBT还原实验发现部分早幼粒白血病细胞胞奖内出现紫蓝色颗粒,并见到核碎解成染色质小体(凋亡小体).③35 d时相上清液孵育的早幼粒白血病细胞部分出现分化现象,部分出现凋亡小体,DNA电泳见梯形带,流式细胞术检测出凋亡峰.④培养35 d的急性髓细胞白血病基质上清液对早幼粒白血病细胞的诱导分化及促凋亡作用明显强于培养14,28 d的急性髓细胞白血病基质上清液及阴性对照组[分化细胞数:1.5±1.8,2.1±1.5,17.3±3.0,41.0±11.1;凋亡细胞数:5.2±1.7,7.3±1.9,10.1±2.2,35.2±13.9,P<0.05],其他组间差异不显著.结论:培养35 d的白血病骨髓基质上清液对早幼粒白血病细胞具有诱导分化、促进凋亡的作用.可能为白血病体外净化提供一种辅助方法.
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血浆置换疗法在皮肤病中的应用
血浆置换疗法(plasma exchange,PE)是一种体外净化(apheresis)方法,通过血细胞分离机、分离膜等去除血浆中的致病因子,如特异性自身抗体、参与组织损伤的非特异性炎症介质(补体、C反应蛋白、纤维蛋白原等)、免疫复合物、胆固醇、巨球蛋白、毒性代谢产物、微生物及其代谢产物等,同时补充适量的正常人血浆、白蛋白或代血浆,从而发挥治疗作用.血浆去除术(plasmapheresis)系指通过在体外去除血浆来治疗疾病的方法.目前PE和血浆去除术已被作为同义词使用.
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Clini MACS纯化自体外周血CD34+造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤1例
多发性骨髓瘤(MM)在自体造血干细胞移植(ASCT)后复发的主要原因,除骨髓清除治疗后患者体内存有残留的肿瘤细胞外,还与干细胞采集物中的肿瘤细胞污染有关[1].移植动员治疗及细胞因子应用后,伴随CD34+造血干细胞的增加循环中肿瘤细胞也增加.分选外周血干细胞(PBSC),即可富集CD34+造血干细胞,又可清除骨髓瘤细胞的污染[2].我们利用此技术,对多发性骨髓瘤病人的自体外周血干细胞移植物进行了体外净化.
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慢性粒细胞白血病骨髓细胞体外培养净化作用实验研究
目的:采用FISH方法直接在干细胞水平对慢性粒细胞白血病(CML)患者自体骨髓体外培养前后的间期细胞进行bcr/abl融合基因检测,从而探讨CML骨髓细胞体外培养对自体骨髓移植物的净化作用.方法:分离初治的慢性期Ph+CML7例骨髓单个核细胞(MNCs),体外培养10d,用免疫磁珠(MACS)富集培养前后的CD34+细胞,通过流式细胞仪检测培养前后MNCs中CD34+干细胞比例,然后用FISH方法检测其中bcr/abl融合基因,同时分别用正常人细胞及K562细胞株作阴性及阳性对照.结果:(1)7例患者骨髓细胞培养前后CD34+细胞中bcr/abl融合基因平均检出率分别为85.3%±4.9%和78%±5.1%,有统计学意义(P<0.05),(2)培养前培养体系中CD34+细胞数量为(6.060±1.564)×105个,培养后体系中的CD34+细胞数量为(5.974±1.424)×105个,两者无明显差异(P>0.05).(3)在对照组中假阳性率为2.5%,假阴性率为2%.结论:自体骨髓细胞体外培养对CML病人的骨髓肿瘤细胞有一定程度的净化作用;FISH技术直接在干细胞水平检测bcr/abl融合基因,且能定量分析,较传统方法更适合对骨髓净化进行评价,为骨髓净化提供了一种更方便、可靠的评定方法.
关键词: 慢性粒细胞白血病 体外净化 荧光原位杂交 Bcr/abl融合基因 -
自制CO2小室行骨髓培养净化应用于自体骨髓移植治疗M4一例
我院对一例M4CR患者行联合IL-2体外净化ABMT术.患者徐某,男,39岁,本市一家公司干部,于我院初诊M4,用HA方案诱导一疗程后即达CR,后至上海瑞金医院求诊进一步确诊为M4,DA方案巩固化疗一疗程.本次入院为第5次,方案为HA,BM 象示CR,可能是患者过于敏感,患者化疗后曾出现粒缺,后经治正常,ABMT术前BM示CR,外周血WBC为1.8×109/L,其他无异常.1 材料与方法 本室改进了吴克复方案[3].自制CO2,小室行骨髓体外培养,现报告如下.
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bcr-abl反义寡核苷酸、白介素-2体外净化慢性粒细胞白血病骨髓的效果
已有研究证明[1~3]:白细胞介素-2(IL-2)、bcr-abl反义寡核苷酸(AS-ODN)可以净化慢性粒细胞白血病(CML)骨髓,而联用这两种药物进行净化报道较少见.本研究根据有关CML的发病机制、细胞特性、基因治疗等方面的研究进展,联合应用bcr-abl AS-ODN、 IL-2对CML骨髓进行体外净化,为临床应用提供实验依据.
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单克隆抗体在恶性血液病自体造血干细胞移植中净化作用研究进展
异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病有效方法之一,特别是具有高危因素患者,异基因造血干细胞移植尤其为首选治疗.近年来随着免疫学的进展,单克隆抗体(以下简称单抗)在自体造血干细胞移植(AHSCT)体内外净化研究中得到广泛应用.单抗因具有高度特异性大大改善了净化的效果,并减少了体内外净化的不良作用.本文拟就近年来单抗在恶性血液病自体造血干细胞移植中净化作用研究进展做一综述.
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白细胞介素-2、干扰素体外净化慢粒白血病骨髓
体外净化一直是学者们关注的热点,已有研究证明[1~3]:干扰素(IFN)、白介素-2(IL-2)可以净化慢性粒细胞白血病(CML)骨髓.本文根据有关CML的发病机制方面研究进展,联合用IL-2、а-IFN方案,从不同机制体外净化CML骨髓,为临床提供实验依据.
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单克隆抗体在恶性血液病造血干细胞移植中应用研究进展
B细胞单克隆抗体、CD34+细胞阳性选择单用或联合应用对淋巴瘤及急性白血病等恶性血液病自体造血干细胞移植物体外净化作用及对移植疗效有显著改善;抗CD20单抗(美罗华)能明显减少移植物中肿瘤细胞的污染,提高自体移植疗效;抗CD52单抗能在体内外有效清除移植物或患者体内的T淋巴细胞,减少移植物抗宿主病的发生率,提高异基因造血干细胞移植疗效.
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CD3AK/iNOS细胞对白血病细胞体外杀伤的研究
背景与目的:LAK细胞已用于临床移植物净化.CD3AK细胞是CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞.本研究旨在经逆转录病毒介导iNOS基因转染人免疫活性细胞CD3AK建立CD3AK/iNOS细胞,并探讨其对白血病细胞株K562及其耐药株K562/ADM的杀伤作用.方法:培养PA317/pLNC-iNOS细胞获得病毒上清;CD3McAb联合小剂量的IL-2激活分离的外周血单个核细胞;含逆转录病毒颗粒的细胞培养上清感染靶细胞CD3AK细胞.测定CD3AK/iNOS、CD3AK细胞培养上清NO含量以及iNOS活性.MTT法观察CD3AK/iNOS、CD3AK对K562和K562/ADM细胞杀伤活性.结果:(1)CD3AK/iNOS、CD3AK中NO含量分别为(378.60±41.57)μmol/L,(98.07±22.31)μmol/L(P<0.001);CD3AK/iNOS、CD3AK中iNOS活性分别为(20.77±2.49)U/ml,(9.81±1.96)U/ml(P<0.001).(2)MTT法观察CD3AK/iNOS对K562和K562/ADM杀伤活性分别为(64.85±18.13)%,(63.80±9.93)%.CD3AK杀伤活性分别为(45.66±17.46)%,(47.85±12.01)%.CD3AK/iNOS与CD3AK相比差异有显著性(P<0.05).结论:CD3AK/iNOS分泌的NO含量、iNOS活性较CD3AK明显提高,且对K562及K562/ADM杀伤作用也更强;但CD3AK/iNOS对K562及K562/ADM杀伤作用无显著性差异.
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自体造血干细胞移植物的免疫净化研究及进展
自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)是保证大剂量化疗和放疗安全用于治疗恶性肿瘤的有效措施.但不论是自体骨髓移植还是自体外周血干细胞移植,移植物中残留肿瘤细胞对移植后复发和总体治疗疗效均有直接影响.因此如何清除移植物中污染的肿瘤细胞成为研究热点之一.目前应用的体外净化的方法较多,主要有物理学(高温、冷冻、微波、光等)、化学(各种化疗药物)、生物学(长期液体培养、反义技术、蛋白酪氨酸激酶抑制物)、免疫学等方法.本文就近年来免疫净化方法(immunologic purging)的研究作一简要综述.
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造血干细胞移植自体造血干细胞移植微小残留病净化
造血干细胞移植(HSCT)是当今治疗白血病和某些实体瘤的主要和有效的手段,甚至是治愈的唯一方法.但是,HSCT后仍有相当一部分病人复发,复发的根源与微小残留病(MRD)有关.因此,HSCT中的MRD治疗是影响疗效的关键,包括AHSCT(自体)和Allo-HSCT(异体).AHSCT与Allo-HSCT相比较其复发率高,原因有二:一是移植物中含有MRD,二是缺乏Allo-HSCT具有的移植物抗瘤(白血病)效应(GVL).针对这两个原因,目前解决的主要手段包括:对移植物进行体外净化;移植后应用免疫调节剂诱导或放大自身免疫诱导抗瘤效应;以及在移植前进行有效的强烈化疗,尽量减少移植物中及移植时体内MRD的负载.
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白血病自体骨髓移植的体外净化
自体骨髓移植治疗白血病的缺点是复发率高,复发主要是回输的自体骨髓中含有残留的微量白血病细胞.在回输前进行骨髓净化具有降低复发率的作用.对自体骨髓在回输前进行体外净化是当前自体骨髓移植研究的主要课题之一.现就近年来骨髓净化的研究综述如下.