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人源抗甲型肝炎病毒Fab在大肠杆菌中的表达及复性
目前已有用于接触前预防的甲肝疫苗,但对于接触后预防,则多采用特异性免疫球蛋白作被动免疫.血源性免疫球蛋白虽应用效果好,但可能被血源中难以检测的病原体污染;鼠源抗体易引起人抗鼠抗体反应.因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂.本文在从噬菌体抗体库筛选的抗甲型肝炎病毒(HAV)人源抗体的基础上,选用大肠杆菌高效表达该抗体Fab,并对表达产物进行了复性.
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热点突变法提高人源抗TNF-α抗体的亲和力
目的通过热点突变法对一株人源抗TNF-α ScFv进行体外亲和力成熟.方法根据体内抗体亲和力成熟时V基因体细胞突变的热点,设计引物进行多步重叠PCR,在本株ScFv的H-CDR3和L-CDR3热点部位引入随机突变,构建噬菌体抗体库,采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行筛选,对选出的克隆测定其相对亲和力,并进一步将4株转换表达成为可溶性Fab,以非竞争ELISA法测定其亲和常数.结果构建了库容为1.8×107的热点突变抗体库,筛选得到了多株亲和力明显提高的抗TNF-α抗体的突变体(多达10倍).结论热点突变法是体外提高抗体亲和力的有效和可行的方法.
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BPI N端优势抗原表位的模拟合成及其人源抗体的筛选
杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是存在于人及哺乳动物多形核白细胞中的一种阳离子抗菌蛋白.
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从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究
目的从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体. 方法 ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定,竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体,中和试验进一步确定中和活性,进而对其序列进行测定和分析. 结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体,竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合,中和试验确定其具有一定中和活性,编号为M1A和P8A,测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆. 结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性,它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础.
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抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达影响因素的研究
目的:为了提高抗体的产量,本文初步探讨了CHO-HB2细胞株表达抗HBsAg人IgG的几种影响因素.方法:采用静置和滚瓶培养,分别观察了CHO-HB2细胞表达抗体的稳定性;不同培养基以及添加剂的效用:细胞接种密度和培养持续时间的选择;金属离子Zn2+的诱导表达作用;滚瓶的培养效果.结果:CHO-HB2细胞的亚克隆株(F4)经液氮冻存半年多复苏后,在无MTX的培养基中连续传代第2个月抗体表达量已开始下降,5个月时接近MTX加压前的基础水平;在培养基中添加多种氨基酸和维生素,并加入适量的Zn2+诱导金属硫蛋白启动子可使表达量明显增加.滚瓶培养又进一步增加了抗体的表达量,其中CHO-HB2在无蛋白的无血清培养基中的表达量从6.2μg/ml提高到28 μg/m1.结论:应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选以及保存,以保持细胞稳定表达抗体的能力;通过优化培养条件,使用完全无蛋白的无血清培养基可收到较好的效果,有利于表达抗体的纯化.
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人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析
目的 筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析.方法 利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列.结果 从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A90值高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A190为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VH Ⅰ亚群,轻链可变区(VL)属于Vk Ⅰ和VkⅢ亚群.结论 从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsng噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础.
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抗TNF-α骆驼化人源sdAbs库的构建及筛选
目的 探索有效的抗体稳定性改构策略,筛选制备抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)稳定、高亲和力人源抗体.方法 基于定点突变技术和核糖体展示技术,对人源抗体片段VH进行骆驼化稳定性改构,构建骆驼化人源单域抗体(single-domain antibodyies,sdAbs)库,以TNF-α作为筛选抗原,筛选特异骆驼化人源sdAbs.结果 以前期构建的人源VH/K基因库为模板扩增VH基因;采用定点突变方法,将VH基因FR2中的4个疏水性氨基酸突变为亲水性氨基酸构建人源骆驼化sdAbs基因库;基于核糖体抗体库技术,构建用于核糖体展示的sdAbs基因库;经体外转录翻译后,以重组TNF-α作为筛选抗原,采用亲和富集法淘选特异性抗体基因;将筛选富集mRNA的RT-PCR基因产物克隆,并在原核系统pET-22b( + )/BL21(DE3)中实现可溶性表达,表达产物经ELISA鉴定,确认具有极高ELISA值的阳性克隆12、40,其序列分析表明是全新的抗TNF-α人源sdAbs;抗原特异性结合活性实验显示两者均可以特异性识别TNF-α,而不能与狂犬病毒糖蛋白和BSA结合,表明它们是特异针对TNF-α的人源基因工程抗体,而且均有很好的抗原浓度依赖性.结论 该研究将抗体稳定性的定向改造法和进化方法相结合,筛选得到了具有较好抗原特异性和良好稳定性的人源抗体,为稳定性人源抗体的制备提供了理论依据及技术基础.
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抗CD20治疗性单克隆抗体的研究进展
作为治疗B细胞淋巴瘤的靶向药物,抗CD20单克隆抗体在治疗性抗体中占有重要的一席之地.经历十几年的研究发展,该类药物结构不断改进,适应症也随之增多.如今,该类抗体不仅可以用于治疗淋巴细胞来源的肿瘤,也逐步应用于一些自身免疫性疾病的治疗,其新型适应症还在不断探索中；同时,该类抗体临床给药方案不断优化,药物反应性不断提高,疗效和毒副作用都得以进一步改善,但和其他化疗药物联合治疗的确切作用机制尚仍有待进一步的深入研究.本文就近年来具有代表性的抗CD20治疗性单克隆抗体的研究新进展做一概述.
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应用核糖体展示技术高效筛选人源抗IgE单链抗体
本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mRNA,采用RT-PCR技术分别构建重链可变区VH(variable region of heavy chain)和轻链可变区VL (variable region of light chain) cDNA库,然后通过连接肽(Gly4Ser)3和特定引物将VH和VL cDNA基因组装成人源单链抗体(scFv)核糖体展示模板基因库.应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源IgE蛋白(免疫球蛋白E)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pET22b(+)载体连接,转化至E coli Rosseta (DE3)宿主细胞,应用菌落PCR结合Dot blotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原ELISA法进一步鉴定阳性克隆.VH和VL基因库得到正确的构建,长度分别为400和710 bp,库容为1013.核糖体展示模板构建正确,长度为1 100bp.该基因库经过3轮针对IgE蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收.经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人IgE蛋白显示强亲和力的阳性克隆菌pET-IgE-6.经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道.结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子.该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考.
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治疗性抗体的研究及其在前列腺癌的应用
免疫治疗是恶性肿瘤治疗的新方向,鼠源单克隆抗体用于人体可能会产生不良反应,而利用DNA重组技术、转基因技术和噬菌体展示技术制备的人源抗体可以克服这种缺陷,人源抗体已成为治疗性抗体的发展趋势.前列腺癌是男性较为常见的恶性肿瘤,目前治疗效果不能令人满意.针对前列腺特异性抗原、前列腺膜抗原和前列腺干细胞抗原等位点的治疗性抗体已经展开实验室和临床研究.利用抗体的导向作用对前列腺癌的靶向治疗,将有巨大的发展前景.
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单链抗体的研究进展
抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段.本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体(single-chain Fv antibody,scFv)的进展情况.
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构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略
构建大容量噬菌体抗体库,可实现不经免疫直接制备针对任意抗原的人源性抗体.本文综述了噬菌体抗体库技术的原理、抗体库的构建方法、不经免疫制备人源抗体的策略以及提高抗体体外亲和力的方法.
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淋巴瘤靶向治疗抗体研究进展
淋巴瘤是一组起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤,在淋巴瘤的治疗中,单克隆抗体发挥着越来越重要的作用,显示出良好的应用前景.目前获得美国食品与药品管理局(FDA)批准的单抗中用于治疗淋巴瘤的有5个:Rituximab、90 Y-Ibritumomab tiuxetan、131 Ⅰ-Tositumomab、Brentuximab vedotin、Alemtuzumab. Blinatumomab、Ofatumumab及Obinutuzumab已获FDA批准用于白血病的治疗,目前正在进行淋巴瘤治疗的临床试验.此外,正在进行淋巴瘤治疗临床试验的单抗药物还有Zanolimumab等.本文对上述淋巴瘤抗体药物进行了综述,同时对我们近研制的淋巴瘤靶向抗体进行了介绍.
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治疗性抗体药物研究与发展趋势
单克隆抗体技术的问世,使研究和生产治疗性单抗药物成为现实.随着基因工程技术的发展,新型的重组抗体技术也随之而生.人们可以利用DNA重组技术对鼠源抗体进行人源化改造、构建合成或半合成抗体库及噬菌体抗体库,从中筛选获得人源抗体,甚至利用转基因小鼠直接获得人源抗体.抗体药物发展的趋势也从鼠源、人一鼠嵌合、人源化到全人源.近年获得批准的抗体药物以全人源为主.1996年至2008年间进入临床研究的人源化单克隆抗体中45%用于治疗肿瘤,28%个用于治疗免疫紊乱.抗体药物的发展进入研发、回报的良性循环,成了国际制药业争夺的焦点.文章就治疗性抗体发展的历史、现状、市场及未来展望作了简要综述.
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人源全分子抗c-Met抗体的制备及对鼻咽癌细胞生物学特性的影响
目的:利用基因工程技术制备全分子人源抗c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE-CLIg-hκ中.转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化.通过ELISA、Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性.CCK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验、Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响.结果:成功重组全分子人源抗c-Met抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性.CCK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞CNE2和HONE1的增殖.细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性细胞CNE2和HONE 1的迁移和侵袭能力.结论:本研究成功制备人源全分子抗c-Met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础.
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登革热病毒(DENV)包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定
目的 建立自外周血快速筛选识别登革热病毒衣壳的人源抗体的方法,从病毒感染者外周血记忆B细胞中筛选出特异性抗体并进行性质分析.方法 通过流式细胞术分选得到外周血中登革热病毒包膜蛋白特异性的单个记忆B细胞,结合高效单细胞PCR技术获得抗体基因序列,对重组表达的单克隆抗体进行结合活性及中和活性检测.结果 成功筛选到识别DENV-1包膜蛋白的6株人源单克隆抗体,其中4株抗体均具有很强的结合活性以及中和活性.结论 成功的通过流式细胞术对DENV特异性记忆B细胞进行分选,并结合单细胞PCR技术,实现了对DENV特异性人源单克隆抗体的高效筛选.通过该平台有希望筛选得到DENV的广谱中和抗体,用于登革热的预防和治疗.
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应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究
目的:构建人源核糖体展示抗体库,筛选制备抗TNF-α的特异性、高亲和力三结构域抗体(VH/K).方法:应用核糖体抗体库技术,从类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示VH/K基因库;体外转录翻译后,以TNF-α重组蛋白作纯化抗原,采用亲和富集法淘选TNF-α特异性抗体基因;将筛选获得的VH/K基因克隆并在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达;表达产物经进行ELISA鉴定,并对阳性克隆的生物学特性进行初步研究.结果:成功构建了库容量约为6.7×1012核糖体展示VH/K抗体基因库,在180个筛选克隆中,其中两株抗体TRB21、TRB409显示出极高的ELISA值,序列分析表明两株克隆具有全新的人源抗以TNF-α抗体基因,他们不仅可以特异识别TNF-α而且可以抑制以TNF-α对L929细胞的细胞毒性.结论:人源抗TNF-α特异性抗体的获得,为进一步研制抗TNF-α的特异性、高亲和力基因工程抗体奠定了基础.核糖体展示技术为体外筛选制备全人源抗体提供了一种简便、有效的技术平台.
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抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达的影响因素探讨
目的探讨CHO-HB2细胞株表达抗HBsAg人IgG的影响因素.方法观察CHO-HB2细胞表达抗体的稳定性,不同培养基以及添加剂的效用,细胞接种密度和培养持续时间的选择,金属离子Zn2+诱导表达的作用,以及滚瓶的培养效果.结果CHO-HB2细胞的亚克隆株F4经液氮冻存半年多复苏后,在无氨甲喋呤(MTX)的培养基中连续传代第2个月,抗体表达量开始下降,5个月时接近用(MTX)施加选择压力前的基础水平.在培养基中添加多种氨基酸和维生素,并加入适量的Zn2+诱导金属硫蛋白启动子,可使表达量明显增加.滚瓶培养可进一步增加抗体的表达量,在无蛋白的无血清培养基中的表达量,从6.2mg/L提高到28mg/L.结论应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选,以保持细胞稳定表达抗体的能力.通过优化培养条件,使用完全无蛋白的无血清培养基,可收到较好的效果,且有利于表达抗体的纯化.
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人源抗体研制及应用进展
单克隆抗体(mAb)技术问世已25年,但由于人mAb制备的困难和鼠mAb的异源性,使mAb在人体内治疗方面的应用进展缓慢.近来由于人源化mAb研制的进展及突破,治疗用抗体的开发呈现了强烈的上升势头,在生物高技术领域中成为一个热点.目前mAb市场正以20%速度递增,预计2002年达11亿美元,占重组药物的9%.10年后市场上的治疗性mAb将从现在的几个增加到100个以上,预计销售额超过500亿美元.我国人源治疗性抗体的研制开发尚处于起步阶段,应当有所加强.
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金属螯合亲和层析法纯化人源抗TNF-α重链可变区蛋白
近年采用基因工程技术进行抗体基因的筛选、改造，获得了大量有用的抗体基因，但如何使之适当地表达和分泌，并获得有效的纯化已成为一个急待解决的问题。就目前研究的进展来看，抗体的表达和分泌不只局限于淋巴细胞和骨髓瘤细胞，在酵母、哺乳动物的非淋巴细胞和大肠杆菌乃至植物细胞中，都能获得抗体的功能性表达、分泌和组装[1-5]。大肠杆菌具有经济、简便和容易操作等特点，将其表达的抗体片段进行有效地纯化，是得到有实用价值制品的重要环节。本文使用表达质粒pQE30，对已获得的人源抗TNFα抗体基因片段进行了高效表达，并用Ni-NTA金属螯合法对表达的抗体片段进行了纯化。
