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人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建
核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.
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核糖体展示技术原理与应用
核糖体展示技术是一种完全的细胞外展示技术,其显著特点是不受细胞转染和表达等因素影响,已经成功用于筛选与靶分子特异结合的高亲和力蛋白,可以筛选出所需要的酶、多肽、抗体等.针对该技术在医药学领域中已成为一种迅速有效的工具,就核糖体展示技术的原理、发展、应用、优缺点作一综述.
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人源核糖体展示单链抗体库的构建
目的 构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库.方法 从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和vL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库.结果 利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库.结论 已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础.
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大容量人源核糖体展示单链抗体文库的构建
目的 构建大容量、多样性的人源核糖体展示(Ribosome display,RD)单链抗体(Singe chain Fv segment,scFv)库.方法 收集20名健康献血者的新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA；设计兼并引物,利用RT-PCR分别扩增人抗体的VH-linker、Vκ、Vλ及Cκ基因；采用重叠PCR(SOE-PCR)技术,构建VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ单链抗体库；将VH-linker-Vκ和VH-linker-Vλ-Cκ等量混合后,与pMD19-T载体连接,并转化感受态E.coli DH5α,对所构建的scFv库进行菌落PCR和测序分析.结果 构建的核糖体展示单链抗体库重组率较高,转化产物经菌落PCR鉴定,均可见约1 000 bp的scFv基因片段,库容量为2.06×1013.经分析该抗体库单链抗体序列均完整,内部无终止密码子,可变区序列无一重复,多样性良好,均具有完整的体外核糖体展示框架.结论 已成功构建了大容量、多样性好的人源核糖体展示单链抗体库,为进一步筛选高特异性、高亲和力的人源抗体奠定了基础.
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核糖体展示技术的研究与应用现状
核糖体展示技术是20世纪90年代建立并发展起来的一种完全在体外进行的分子筛选与进化技术,避免了体内展示技术的缺陷,不受细胞转染与基因表达等因素影响,已经成功用于筛选与靶分子特异结合的高亲和力多肽、抗体和酶等.本文主要概述了核糖体展示技术的基本原理、具体步骤、技术改进及应用现状.
关键词： 核糖体展示 体外筛选 蛋白质-核糖体-mRNA三元复合物 -
核糖体展示技术
克隆展示技术(cloning display)是一种筛选蛋白质强有力的工具,该技术将基因型和蛋白表型联系在一起,利用目标蛋白的特异性配基可从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白和相应基因序列.
关键词： 核糖体展示 -
体外展示技术
以体外选择方法筛选不同功能的核酸、肽和蛋白是近年的研究热点.体外展示方法不受细胞转化效率限制,可建立多达10~(13)～10~(14)分子的大容量库.应用广泛的体外展示技术是核糖体展示和mRNA展示技术.核糖体展示通过在体外翻译反应时终止蛋白质合成,获得mRNA-核糖体-新生肽复合物.mRNA展示利用小的连接分子,主要是嘌呤霉素形成mRNA-蛋白质复合物,这些mRNA-蛋白质复合物纯化之后用于体外筛选.体外展示技术为体外筛选和蛋白质进化提供了另外的途径,本文将对核糖体展示和mRNA展示技术的原理、方法和应用研究作一综述.
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抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定
目的 构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(scFv)库,并筛选出特异性高的抗体.方法 从A549细胞的cDNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体pET-28a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠.从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)、VH接头(VH-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物VH/Vκ.VH/Vκ与pUM19-T载体连接并转化至E.coli DH5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序.使用TNT(R) T7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定.结果 经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(VH/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp.经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力.结论 成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示scFv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标scFv.
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应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究
目的:构建人源核糖体展示抗体库,筛选制备抗TNF-α的特异性、高亲和力三结构域抗体(VH/K).方法:应用核糖体抗体库技术,从类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示VH/K基因库;体外转录翻译后,以TNF-α重组蛋白作纯化抗原,采用亲和富集法淘选TNF-α特异性抗体基因;将筛选获得的VH/K基因克隆并在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达;表达产物经进行ELISA鉴定,并对阳性克隆的生物学特性进行初步研究.结果:成功构建了库容量约为6.7×1012核糖体展示VH/K抗体基因库,在180个筛选克隆中,其中两株抗体TRB21、TRB409显示出极高的ELISA值,序列分析表明两株克隆具有全新的人源抗以TNF-α抗体基因,他们不仅可以特异识别TNF-α而且可以抑制以TNF-α对L929细胞的细胞毒性.结论:人源抗TNF-α特异性抗体的获得,为进一步研制抗TNF-α的特异性、高亲和力基因工程抗体奠定了基础.核糖体展示技术为体外筛选制备全人源抗体提供了一种简便、有效的技术平台.
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真核表达系统的抗体库技术研究进展
单克隆抗体(mAb)药物研制经历了鼠源性、人鼠嵌合、人源化改造以及全人源这4个阶段,其中全人源抗体因其免疫原性低而得到相对广泛的应用.全人源抗体的制备主要包括转基因鼠技术和抗体库技术,在抗体库技术中主要包括基于原核表达系统的噬菌体技术和基于真核表达系统的核糖体技术、酵母技术以及哺乳动物细胞技术.本文主要综述了近些年来基于真核表达系统的抗体库技术的研究发展.
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核糖体展示单链抗体库技术及应用的研究进展
核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和鉴定的新技术,避免了传统的体内筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.它将正确折叠的蛋白及其mRNA同时结合在核糖体上,形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,使目的蛋白的基因型和表型联系起来.近年来,核糖体展示技术在单链抗体(ScFv)库构建及应用方面取得了很大进展.现就这方面的研究进展作一综述.
关键词： 核糖体展示 mRNA-核糖体-蛋白质三聚体 单链抗体
