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刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定
目的 从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白. 方法 分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GST-MIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析. 结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35～45 ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白. 结论 经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶.
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刚地弓形虫MIC2突变体的构建及其特性分析
目的 利用基因定点突变的方法将刚地弓形虫微线体蛋白2 (MIC2)的767位氨基酸的碱基定点突变,蛋白相互作用技术分析突变体的特性.方法 利用基因定点突变的方法,将MIC2蛋白羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(tryptophan,W)的碱基突变为丙氨酸(alanine,A)的碱基,PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白.以该蛋白和MIC2C蛋白(未突变蛋白)为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析.结果 获得了MIC2C W/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白;GST pull-down实验产物分析显示GST-MIC2CW/A蛋白的产物中未见蛋白条带,而未突变蛋白的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别.结论 在体外获得了MIC2突变体;MIC2突变体不能沉降弓形虫裂解液中的醛缩酶,即MIC2突变体失去了与醛缩酶作用的特性.
关键词： 刚地弓形虫 微线体蛋白2 点突变 GST pull-down -
GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用
目的 构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pull down方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用.方法 以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌B.21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白；将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用.结果 酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMPI融合蛋白原核表达载体；考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMPI融合蛋白；GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用.结论 获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用.
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筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白
目的：采用 pull-down技术筛选乳源抗癌六肽( PG-PIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上的靶点蛋白(受体)并进行鉴定。方法以 PGPIPN 的序列为参照，设计出 PG-PIPN基因，以BamH Ⅰ/Xho Ⅰ为酶切位点，将PGPIPN基因构建到表达质粒载体pGEX-4T-1中，转化到E. coli BL21中，用诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG)低温诱导表达的谷胱甘肽S转移酶( GST)标签融合蛋白作为诱饵蛋白；从SKOV3中提取的总蛋白作为捕获蛋白，运用 GST pull-down技术，筛选出靶点蛋白质，运用SDS-PAGE电泳进行初步鉴定，并用异硫氰酸荧光素( FITC)标记的PGPIPN孵育鉴定。结果 SDS-PAGE 电泳中有两条条带，一条为诱饵蛋白，一条为目的条带，在免疫荧光显微镜下观察到荧光PG-PIPN结合到该条带上。结论筛选和鉴定了PGPIPN作用于卵巢癌细胞上的靶蛋白，为研究其抗癌的作用机制及其信号转导通路奠定了基础。
关键词： 乳源抗癌六肽 GST pull-down 诱饵蛋白 捕获蛋白 靶点蛋白 -
弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选
目的 筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白.方法 以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物；将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白.制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物.结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致；制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别.结论 采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶.
关键词： 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 GST pull-down 醛缩酶 -
刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定
目的：确定刚地弓形虫微线体蛋白2（M IC2）与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术，将M IC2羧基端（MIC2C）的767位色氨酸（W767）突变为丙氨酸（A）。PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段；构建MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统，IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白（对照蛋白）作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验，SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2C W/A突变体基因片段，制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白；GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带，而且可以被醛缩酶抗体识别，而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论将MIC2的W767突变为A后，MIC2失去与醛缩酶的作用，即M IC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸（W ）。
关键词： 刚地弓形虫 微线体蛋白2 醛缩酶 点突变 GST pull-down -
Daxx与雄激素受体结合的功能片段筛选
目的 体外筛选出能与雄激素受体具有相互作用的Daxx结构域.方法 应用聚合酶链反应扩增Daxx四个不同功能结构域,分别连接到带有GST标记的原核表达质粒pGEX-6p-1中,构建Daxx四个功能结构域的原核表达载体.经测序鉴定转化E Coli.BL21DE3菌株,经氨苄青霉素筛选并扩增阳性克隆,用IPTG诱导蛋白表达后纯化蛋白,采用GST pull-down体外筛选出与雄激素受体具有相互作用的Daxx功能结构域.结果 Daxx不同功能结构域的四个原核表达载体pGEX-6p-1/Daxx/DM1-240、pGEX-6p-1/Daxx/DM241-501、pGEX-6p-1/Daxx/DM502-625和pGEX-6p-1/Daxx/DM626-740经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析,证实插入质粒的片段大小正确,无读码框移位和突变.IPTG诱导后蛋白表达具有明显差异性,表达蛋白与预期表达蛋白质分子量大小相当.纯化蛋白进行GST pull-down实验结果显示Daxx与雄激素受体具有相互作用.结论 Daxx通过第626-740位氨基酸序列与雄激素受体相互结合.
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LRP16与ART-27的相互作用的鉴定
目的:鉴定LRP16与ART-27的相互作用,推测LRP16基因在肿瘤发生、发展中涉及到的信号途径.方法:酵母双杂交系统筛选出ART-27可与LRP16相互作用,采用酵母双杂交回复验证、免疫共沉淀及GST pull-down等体内、体外方法对二者之间的相互作用进行验证.结果:LRP16与ART-27在体内、体外均可形成复合物.结论:ART-27是LRP16的特异性结合蛋白,二者的相互作用为进一步研究LRP16在胚胎发育及肿瘤发生、发展中的功能及信号传导途径奠定了基础.
关键词： LRP16 ART-27 蛋白相互作用 免疫共沉淀 GST pull-down -
人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用
目的 在细胞水平及体外验证腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体是否存在相互作用.方法 采用激光共聚焦免疫荧光实验,通过细胞内蛋白共定位确定蛋白质间的相互作用关系;GST Pull-down实验在体外验证CAP1与PIF1及其剪接体是否存在直接的相互作用.结果 激光共聚焦免疫荧光实验显示,CAP1与PIF1全长蛋白及其剪接体BC018978没有共定位,但与剪接体AF108138C存在共定位.GST Pull-down未检测到CAP1与PIF1全长及其剪接体的相互作用.结论 CAP1与PIF1剪接体蛋白可能存在非直接相互作用.
