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皮肌炎知识十二问(二)
问题5皮肌炎需要做哪些检查?1.体格检查.2.肌肉磁共振成像:可探知肌肉的受累范围,用以诊断分类和治疗管理.它也可引导合适的活检部位.3.肌电图检查:以针电极插入到骨骼肌,在细胞外记录、放大,并通过示波器显示肌纤维的电活动,用于帮助诊断和鉴别诊断.4.病理活检:帮助诊断和鉴别诊断.5.血清酶测定:高水平的血清肌酶是肌肉受累的标志性参数.在疾病急性期,肌肉损伤释放到血清中的肌酸激酶(CK)是敏感的肌酶,醛缩酶、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)也可升高.6.自身抗体:帮助诊断,也有助于肌炎进一步分类.
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激活低氧诱导因子-1的转导通路
低氧诱导因子-1(HIF-1)与心血管缺血、肺高压和癌症等有密切关系,是在低氧的肝细胞癌细胞株hep3B细胞的核提取物中发现的,是一种结合于促红细胞生成素(EPO)基因增强子的寡核苷酸序列的特异蛋白.据报道,许多类型的细胞都可被低氧诱导而产生效应,其中HIF-1起主要作用,提示细胞中普遍存在一个低氧转导机制.一些转录因子,如活化蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)、HIF-1[1]都与低氧应激反应有关.哺乳动物细胞对缺氧的适应性反应主要是表达HIF-1,这一过程与某些蛋白基因如醛缩酶A、烯醇化酶α、乳酸脱氢酶LDH、丙酮酸激酶和葡萄糖转移酶-1(GLUT-1)的表达有密切关系[2].
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阿兹海默症中S-亚硝基化蛋白质组确定及功能分析
蛋白质的S-亚硝基化修饰在阿兹海默症（AD）发病机制中的影响已有初步研究成果，实验证明阿兹海默症中错误折叠的蛋白质形成与聚集均与蛋白质亚硝基化修饰有关联。近期，来自巴基斯坦卡拉奇大学和德国哥廷根大学医学中心的研究团队对阿兹海默症中发生S-亚硝基化修饰的蛋白质进行了筛查，并确定出45个蛋白靶点，其中超氧岐化酶（SOD2）［Mn］、果糖二磷酸醛缩酶C（ALDOC）和电压依赖阴离子选择性通道蛋白2（VDAC2）三种蛋白检测出与之前报道不同的S-亚硝基化信号。另外，神经萎缩严重的AD区域蛋白质的S-亚硝基化信号也更强烈。
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刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定
目的 从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白. 方法 分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GST-MIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析. 结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35～45 ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白. 结论 经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶.
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醛缩酶A基因促进肝癌细胞增殖
目的：初步探索醛缩酶A基因敲除与过表达对肿瘤细胞生长的影响，确定无氧代谢过程中醛缩酶与肿瘤生长代谢之间的关系。方法通过表达载体质粒构建与慢病毒感染构建稳定表达的醛缩酶A过表达与基因敲除细胞，在基因和蛋白水平验证重组细胞，观察细胞增殖速度改变。结果实时定量PCR结果显示，过表达细胞系中目的基因的表达约为正常细胞的2倍；根据醛缩酶A RNA序列设计5个干扰靶点，其中醛缩酶A4对于目的基因的干扰效果为显著，重组后的细胞醛缩酶A mRNA表达水平为正常细胞的1/50。与正常对照组相比，醛缩酶A过表达细胞在48 h增殖率增加40%，增殖率与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）；醛缩酶A RNA干扰表达细胞在24 h增殖率降低86%，与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论醛缩酶A的表达差异对肝癌肿瘤细胞生长有明显影响。
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酶单位换算法(2)
名称(代号)测定方法习用单位换算系数国际单位(SI)醛缩酶(ALD)U/L0.03084μmol*s-1/L单胺氧化酶(MAO)U/L0.2779μmol*s-1/Lα-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)25 ℃测定法U/L0.01667μmol*s-1/L葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)mU/ml0.01667μmol*s-1/L血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE-Ⅰ)mU/ml0.01667μmol*s-1/L
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胆汁酸和醛缩酶检测在原发性肝癌介入治疗中的应用
原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是我国尤其是南方常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,危害大,就诊时多数已属中晚期,失去了手术治疗时机.近几年,介入治疗是非手术治疗中晚期PLC的首选方法之一[1],对肝癌晚期已失去手术切除机会的患者,采取本法是一种比较有效和安全的姑息性方法,它能减轻患者痛苦,延缓病程进展,延长患者生命.胆汁酸(total bile acid, TBA)和醛缩酶(aldolase,ALD)是反映肝脏损伤的一个比较灵敏的指标.本文旨在探讨TBA和ALD检测对PLC介入治疗的效果观察,从而为临床评价治疗PLC疗效提供更多、更准确的信息,现报告如下.
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旋毛虫病血清酶学检测进展
旋毛虫病(trichinosis)是一种严重危害健康的人兽共患寄生虫病.血清酶的实验室检查对旋毛虫病有很重要的辅助诊断价值,特别是肌酸激酶(CK),醛缩酶(ALD),谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),乳酸脱氢酶(LDH)等五种血清酶的辅助诊断价值较大,其它血清酶则相对价值较小.
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遗传性果糖不耐受症患儿的饮食治疗效果分析
遗传性果糖不耐受是由常染色体隐性遗传所致的遗传代谢病,是由于果糖代谢途径中,果糖二磷酸醛缩酶缺陷所致.发病与所用饮食中含蔗糖和果糖成份有关,若不及时终止这类食物则患儿迅速出现食欲不振、腹泻、体重不增、肝肿大、黄疸、浮肿和腹泻等症状,少数患儿可能因未及时诊断治疗而死于进行性肝功能衰竭.该病发病率低,欧洲发病率约为1:26100.
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定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点
目的 利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6 (MIC6)与醛缩酶的作用位点. 方法 根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C) 348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(Ⅴ)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21 (DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物.以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物.分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物. 结果 获得了MIC6CW/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白.GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带. 结论 色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点.
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GST沉降技术验证弓形虫醛缩酶与肌动蛋白的相互作用
目的 通过GST沉降技术(GST pull-down)验证刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)与肌动蛋白(actin)的相互作用. 方法 PCR扩增弓形虫cDNA中aldolase和actin基因,分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1和pET30a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物.采用腹部皮内多点注射免疫SD大鼠15只,首次免疫Actin-His6蛋白量为200μg/只,第2次起免疫蛋白量为100μg/只,共免疫4次,每次间隔7d,末次免疫后5d收集心脏血,制备Actin-His6抗血清.以纯化的GST-Aldolase蛋白作为探针蛋白与Actin-His6蛋白液进行GST沉降实验,实验产物进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析. 结果 获得了弓形虫aldolase和actin基因序列,构建了相应的原核表达载体.表达并纯化了GST-Aldolase和Actin-His6蛋白.Actin-His6蛋白免疫SD大鼠后获得其抗血清,经抗体亲和纯化柱纯化,获得Actin-His6多克隆抗体.SDS-PAGE和Western blotting结果显示,GST沉降实验产物中的蛋白条带可被Aldolase-His6多克隆抗体和Actin-His6多克隆抗体识别.结论 弓形虫醛缩酶与肌动蛋白存在相互作用.
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恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达
目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶(ALD)编码区基因.方法利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE-30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达.结果PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同.重组融合蛋白通过镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化.结论我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达.
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蒿甲醚对日本血吸虫磷酸葡萄糖变位酶、醛缩酶、磷酸甘油酸变位酶和烯醇化酶的影响
[目的]观察蒿甲醚(Art)对小鼠体内日本血吸虫磷酸葡萄糖变位酶(GPM)、醛缩酶(ALD)、磷酸甘油酸变位酶(PGM)和烯醇化酶(ENO)的影响.[方法]小鼠感染血吸虫尾蚴4～5 wk后,1次灌服Art 100mg/kg或300 mg/kg,并于24～48 h后剖杀,收集日本血吸虫雌虫和雄虫,按NADPH的生成量或NADH的耗用量测定虫体的上述4种酶活力.[结果]经Art 100 mg/kg作用24 h后,雌虫的GPM、ALD、PGM和ENO活力分别较对照组下降15%、19%、50%和46%,其间差别均具有显著意义,而雄虫仅PGM和ENO活力分别下降22%和32%;48 h后,雄虫的GPM和ALD活力亦分别下降21%和18%,雌虫的GPM、ALD、PGM和ENO及雄虫的PGM和ENO活力则进一步下降.经Art 300 mg/kg作用后24～48 h,雌虫和雄虫的上述4种酶活力均明显下降,且呈一定的时间效应关系.[结论]Art对日本血吸虫尤其是雌虫的上述4种酶有抑制作用.
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重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备
目的鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶(ALD),制备针对此酶的单克隆抗体.方法用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因,经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠,腹腔注射免疫3次,每次间隔2周,加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体.同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验(IFAT)和蛋白质印迹(Westernt blotting)分析.结果ELISA检测表明,小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1:105,IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原;Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量(Mr)约41 000;所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应.经ELISA检测3次,筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫;抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型.结论本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶,并获得特异性的单克隆抗体.
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间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定
目的:克隆间日疟原虫醛缩酶(Plasmodium vivax aldolase,PvALD)基因,体外表达和鉴定重组PvALD蛋白.方法:PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvALD基因,构建pET32c-PvALD重组表达质粒,转化大肠埃希菌(E.coli) BL21(DE3+),诱导表达带有His标签的重组蛋白,并对PvALD在E.coli中表达进行优化,观察诱导时间、诱导剂浓度、培养基种类对该蛋白原核表达的影响.采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,相应表达物分别采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定.结果:PvALD的PCR产物分子量为1.1 kb,重组质粒pET32c-PvALD经测序验证,其插入片段序列与GenBank参考序列相似性为100%,转化E.coli所表达的重组蛋白分子量约为60 kD.PvALD在LB中1 mmol/L IPTG诱导6 h条件下获得佳的表达效果.亲和层析纯化后的PvALD经SDS-PAGE电泳检测,呈现单一条带,Western blot分析结果显示,该重组蛋白只能被间日疟患者血清特异性识别,而不能被恶性疟患者血清识别.结论:成功克隆了PvALD基因,表达了重组PvALD蛋白,为以PvALD作为靶标的间日疟快速诊断方法提供了基础.
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弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶相互作用的鉴定
目的 鉴定弓形虫MIC6羧基端和醛缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位.方法 分别用GST-MIC6C多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀实验,实验产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.弓形虫速殖子涂片,免疫荧光定位法确定两种蛋白在虫体内的定位.结果 与对照相比,GST-MIC6C多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白条带可分别被相应的抗体识别.荧光显微镜下显示,MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)两种蛋白皆定位于弓形虫的顶端.结论 弓形虫MIC6羧基端与醛缩酶存在相互作用并在虫体内存在共定位关系.
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弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选
目的 筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端(MIC6C)相互作用的蛋白.方法 以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物；将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白.制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物.结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致；制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别.结论 采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶.
关键词： 刚地弓形虫 微线体蛋白6羧基端 GST pull-down 醛缩酶 -
刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定
目的：确定刚地弓形虫微线体蛋白2（M IC2）与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术，将M IC2羧基端（MIC2C）的767位色氨酸（W767）突变为丙氨酸（A）。PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段；构建MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统，IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白（对照蛋白）作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验，SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2C W/A突变体基因片段，制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白；GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带，而且可以被醛缩酶抗体识别，而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论将MIC2的W767突变为A后，MIC2失去与醛缩酶的作用，即M IC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸（W ）。
关键词： 刚地弓形虫 微线体蛋白2 醛缩酶 点突变 GST pull-down -
丁酸钠对Bel-7402人肝癌细胞几种酶活性的影响
为了探讨丁酸钠对人肝癌细胞各种酶活性的影响,采用丁酸钠处理Bel-7402人肝癌细胞,测定其γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶(TAT)、醛缩酶(ALD)的比活力和细胞增殖速度.结果显示,2.5mmol/L和5.0mmol/L的丁酸钠能明显抑制人肝癌细胞增殖,并使肝癌标志酶γ-GT活性及反映肝细胞恶变或损伤的ALD活性明显降低(P＜0.01,P＜0.05),而使反映肝细胞分化的TAT活性明显升高(P＜0.01,P＜0.05).结果表明,丁酸钠能引起人肝癌细胞γ-GT、TAT、ALD明显改变,提示这几种酶可作为肝癌细胞分化诱导的酶学指标.
关键词： 丁酸钠 人肝癌细胞 γ-谷氨酰转肤酶 酪氨酸-α-酮戊二酸转氨酶 醛缩酶
