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蚊传黄病毒的蚊虫细胞受体研究现状
研究日本脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒这三种蚊传黄病毒在蚊虫细胞上的受体特性及功能,对于终揭示这三种蚊传黄病毒的致病机理,切断蚊传黄病毒传播途径具有重要的意义.本文介绍了这三种蚊传黄病毒相似的受体结合蛋白的结构与膜融合机制,综合论述了在C6/36细胞上受体研究的进展,推测这三种蚊传黄病毒可能在蚊虫细胞上有相同的受体分子.
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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法
目的 应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性.结果 应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142bp、293bp、377bp、630bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5000PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105 copies/μl、2.6×104 copies/μl和1.37×104 copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应.结论 应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测.
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快速检测日本脑炎病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立
[目的]建立一种能快速区分、简便诊断日本脑炎病毒的胶体金标记免疫层析试纸条方法,并对其进行评价.[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并标记日本脑炎病毒的NSl的抗体,制成免疫层析检测试纸条.对试纸条进行特异性和敏感性评价,并对三带喙库蚊进行模拟添加日本脑炎病毒检测.[结果]用三带喙库蚊研磨悬液上清、正常的昆虫细胞液进行测试,呈阴性反应;检测日本脑炎病毒的灵敏度均为1×105 pfu/ml,对三带喙库蚊添加日本脑炎病毒进行检测也取得同样结果,并在10～15min即可得到结果.[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测日本脑炎病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础.
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日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定
在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白.进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础.
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日本脑炎病毒血清学和分子生物学快速诊断技术研究进展
日本脑炎病死率高,后遗症严重;对人类和多种动物的危害非常大,因此日本脑炎病毒的快速诊断尤为重要.本文就日本脑炎病毒的血清学和分子生物学等方面的快速诊断方法的研究进展作一综述.
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一株抗JEV单抗可变区的计算机建模及其与JEV E蛋白的分子对接
目的 利用计算机建模获得单克隆抗体2F2可变区三维结构,再与日本脑炎病毒(JEV)E蛋白进行模拟分子对接,了解JEV E蛋白上与2F2作用的关键氨基酸位点,为阐明2F2的中和作用机制奠定基础.方法 利用BLASTP软件在蛋白质数据库(PDB)中搜索2F2同源蛋白.以同源蛋白为模板,用Modeller软件对2F2可变区主链、侧链进行建模,组装出完整的2F2可变区三维结构模型并进行一系列分子动力学优化,得到能量低的单抗可变区三维结构.后利用Discovery Studio软件模拟2F2可变区与JEV E蛋白的分子对接.结果 获得2F2可变区三维结构模型.模拟分子对接结果显示JEV E蛋白上与2F2可变区相互接触、作用的氨基酸位点有9个,即Ⅰ区的13位谷氨酸、16位丝氨酸、37位天冬氨酸和300位苏氨酸,Ⅲ区的336位赖氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸残基.其中Ⅰ区13位谷氨酸、16位丝氨酸和37位天冬氨酸可能是中和表位必需的氨基酸.Ⅲ区的387位精氨酸和388位甘氨酸位于优势中和抗原表位区域,336位赖氨酸与已报道的337位中和表位非常接近.结论 通过计算机建模确定JEV E蛋白上有9个与单克隆抗体2F2作用的主要氨基酸位点,为利用E蛋白突变体阐明2F2单抗的中和机制提供了依据.
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日本脑炎病毒受体74×103分子的分离与初步鉴定
目的 分离和初步鉴定口本脑炎病毒(JEV)易感细胞C6/36和Vere细胞上受体分子.方法 应用免疫共沉淀(Co-IP)技术,从C6/36和Vero细胞分离与JEV结合的受体分子,做质谱分析鉴定和Western blot检测.用激光共聚焦技术(LSCM)观察候选受体分子在细胞膜上的定位及与JEV结合的情况.结果 经过Co-IP反应,从C6/36、Vem细胞上分离出多个与JEV结合的分子条带.质谱分析首次鉴定出一个蛋白,即C6/36细胞上与JEV结合的相对分子质(Mr)为74×103分子,为HSC70蛋白.进一步用抗HSC70抗体做Western blot,榆测剑从C6/36和Vem细胞膜上Co-IP分离出的74×103蛋白.LSCM观察到JEV吸附在C6/36细胞膜上时,HSCT0蛋白与JEV共定位.结论 C6/36细胞上Mr为74×103的HSC70可能是JEV的受体分子.
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重要蚊媒黄病毒对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用
目的:比较并探讨日本脑炎病毒Beijing-1株和登革2型病毒43株对宿主细胞内IFN-α介导的信号转导通路抑制作用的机制.方法:采用含萤火虫荧光素酶(Luciferase,Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,通过检测IFN刺激应答元件(IFN-stimulated response element, ISRE)活性对病毒感染细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的抑制作用进行定量分析.利用间接免疫荧光法观察在IFN-α作用下病毒感染细胞内STAT1分子的分布情况.进一步采用Western印迹分别检测在这两种病毒感染状态下宿主细胞内STAT1、JAK1和TYK2的磷酸化水平.结果:感染日本脑炎病毒和登革病毒的细胞在IFN-α作用下,ISRE活性与对照组相比均显著下降,而且日本脑炎病毒对宿主细胞内ISRE活性的抑制程度明显强于登革病毒;进一步研究发现,日本脑炎病毒可通过抑制JAK1和TYK2两种激酶的活性,降低STAT1的磷酸化水平,阻碍STAT1的核转运;而登革病毒则只抑制TYK2激酶的活化,降低STAT1的磷酸化及核转运水平.结论:日本脑炎病毒和登革病毒可通过不同的作用机制抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路.
关键词： Ⅰ型干扰素 JAK-STAT信号转导通路 日本脑炎病毒 登革病毒 -
噬菌体表达短肽模拟乙脑病毒糖蛋白的研究
为研究日本脑炎病毒(JEV)E蛋白模拟肽,将抗JEV E蛋白的mAb 2H4淘筛噬菌体15肽库.经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个阳性克隆,测序并与JEV E蛋白同源比较.将阳性噬菌体免疫小鼠,检测血清中特异性抗体.ELISA结果显示筛选到的噬菌体能特异地与mAb 2H4结合,并且这种结合可被JEV天然抗原所竞争抑制.10个阳性克隆的氨基酸序列相同:-RQDPQWPYANSTIAR-,同源分析得到的序列STXAR可能为mAb 2H4识别的模拟表位.阳性噬菌体表达的15肽能够刺激小鼠产生特异性抗体.该噬菌体表达短肽模拟JEV E蛋白的部分抗原性.
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日本脑炎病毒DNA疫苗和基因工程亚单位颗粒疫苗的动物保护实验研究
目的评价3种日本脑炎病毒(JEV)新型疫苗,即E蛋白病毒样颗粒(VLPs)、DNA疫苗(pV/JE)以及E蛋白颗粒(Eps)的动物免疫效果.方法 BALB/c小鼠经2次接种疫苗后,测定其病毒特异性的CTL活性、结合抗体、中和抗体,并以10LD50 JEV攻击免疫小鼠,观察其保护效果.结果各新型疫苗组的CTL活性为33%～56%,灭活疫苗组为22%,而载体和PBS对照组的CTL活性分别为17% 和18%.一次免疫后,实验组小鼠血清结合抗体阳转率为90%.除DNA疫苗组外,各组小鼠的二次免疫血清抗体效价高于一次免疫的抗体效价(P＜0.05),且以VLPs加佐剂组小鼠血清抗体效价高,Eps加佐剂组次之,均高于pV/JE组和灭活疫苗组(P＜0.05).三种疫苗可诱发小鼠产生中和抗体.各实验组小鼠能够抵抗JEV 的攻击,而对照组小鼠的死亡率为37.5%.结论三种新型疫苗可以正确表达JEV 的E蛋白表位,可诱发免疫小鼠产生抗JEV的中和抗体并有保护性作用,免疫效果优于灭活疫苗,有可能成为候选的JEV新型疫苗.
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DDX60通过促进小胶质细胞的细胞免疫反应抑制日本脑炎病毒复制
目的 探索DDX60对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)复制的影响,并初步确定其影响机制.方法 以小鼠小胶质C8-B4细胞作为研究对象,对其进行JEV感染实验,以感染紫外灭活JEV细胞作为对照组,采用RT-qPCR(实时定量逆转录聚合酶链反应)测定感染后两组细胞中DDX60的表达,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测两组细胞中免疫因子的水平.利用Lipofectamine 2000将DDX60敲降或过表达质粒转染入C8-B4细胞,对照组细胞转染空载质粒,采用RT-qPCR和Western印迹检测病毒RNA和蛋白水平变化,采用ELISA检测细胞中免疫因子表达水平的变化.结果 JEV组细胞中DDX60 mR-NA表达量显著低于正常细胞组(P<0.05, P<0.01); DDX60过表达组中病毒RNA水平和蛋白水平明显降低(P<0.05, P<0.01),而DDX60敲减组中其水平显著升高(P<0.01, P<0.001);与JEV失活组相比,JEV组细胞中免疫因子的水平显著提高(P <0.05, P <0.01, P <0.001);与正常对照组相比, DDX60敲减组中细胞免疫因子的表达水平明显下降(P<0.05),而DDX60过表达组中免疫因子的表达水平明显上升(P<0.05).结论 JEV感染可显著抑制C8-B4细胞中DDX60的表达,并促进细胞中免疫因子的释放;DDX60可增强感染病毒的C8-B4细胞中免疫因子的表达.综上,DDX60通过提高细胞的免疫反应进而抑制病毒的复制.
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日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用
根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)SA14-14-2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因,其中含ha基因主要核苷酸序列.将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-EHA.阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在.Western-blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性.利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验.结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法.
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乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究
本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.
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HeLa细胞膜上日本脑炎病毒受体候选分子的初步鉴定
目的：寻找HeLa细胞膜上可与日本脑炎病毒（JEV）结合的分子。方法采用免疫共沉淀（Co-IP）技术，分离HeLa细胞膜上可与JEV特异结合的分子，对SDS-PAGE特异条带进行质谱分析，并经Western blotting和酶联免疫吸附试验（ELISA）验证其与JEV的特异结合。结果 Co-IP复合物经SDS-PAGE分离出多个条带，选择明显的3条带进行了质谱分析，结果显示分别为真核细胞翻译延长因子2（eEF2）、热休克蛋白90β（HSP90β）和微管蛋白α6。利用兔抗人HSP90β单克隆抗体进行Western blotting和ELISA实验，证实了细胞膜中确有HSP90β且可与JEV特异性结合。结论 HSP90β是HeLa细胞膜JEV受体的候选分子。
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西尼罗河病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用研究
建立特异、敏感、快速检测西尼罗河病毒(WNV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法.方法:针对西尼罗河病毒囊膜蛋白(E)的保守序列设计引物,建立WNV的实时荧光定量检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性以及稳定性.对保存的54例WNV感染者的血清样本进行检测,分析其检测的准确性.结果:建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法对WNV的检测具有高度的特异性,而对日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)等均无交叉反应,检测的灵敏度可达到100 pg.标准曲线具有较好的线性关系,相关系数为0.995,实时荧光定量PCR效率为100％.对54例WNV感染样本进行检测,准确率高达98.15％.结论:实时荧光定量PCR技术检测WNV具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可作为临床诊断WNV的手段.
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IgG Fc基因增强乙型脑炎DNA疫苗细胞免疫效应的分析
目的 评价IgG Fc段编码基因不同构建方式对乙型脑炎(JE)DNA疫苗细胞免疫应答的影响.方法 以套式RT-PCR法获取BALB/c鼠IgG Fc编码基因,构建含乙型脑炎病毒(JEV)prME蛋白与IgG Fc编码基因以及单纯IgGFc编码基因重组质粒,分别命名pJME/IgG Fc和pIgG Fc,以不同免疫原肌注免疫BALB/c小鼠,经流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾T淋巴细胞亚群及Th细胞内细胞因子(IFN-y、IL-4)变化,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法测定细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)活性.数据进行单因素方差分析.结果 pJME/IgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例为(66.64±5.84)％,明显高于pJME+pIgG Fc、pJME、JE灭活疫苗和pcDNA3.1(+)组(P＜0.05),pJME+pIgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例(60.55±2.09)％,高于pJME组(52.86±1.92)％,也高于JE灭活疫苗组(55.77±1.62)％(P＜0.05),pcDNA3.1(+)组CD4+T淋巴细胞比例为(37.82±4.93)％,明显低于其他组(P＜0.05);pJME/IgG Fc与pJME+pIgG Fc免疫组CD8+T细胞比例较空载体pcDNA3.1(+)及灭活疫苗组升高(P＜0.05).pJME/IgG Fc免疫组CTL活性为(46.92±1.97)％,明显高于其它组(P＜0.05).pJME/IgG Fc、pJME+pIgG Fc免疫组IFN-γ+CD4+T淋巴细胞比例分别为(37.90±4.79)％、(21.53±4.61)％,明显高于其它组(P＜0.05).结论 相对于pJME+pIgG Fc联合免疫组,pJME/IgG Fc融合质粒免疫组能够诱导更强的细胞免疫反应.
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日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定
目的 构建日本脑炎病毒核心蛋白(JEV C蛋白)基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应.方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoR1/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定；PE G/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化人酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用；用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达.结果 重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致；成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均＞0.8,在SD/-TrpPMA培养基上均不生长；经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC.结论 成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pCBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pCBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础.
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日本脑炎病毒基因片段-GM-CSF双顺反子表达载体的构建
目的利用分子生物学技术,构建pCAG-JG双顺反子真核表达质粒,为研制新型的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)核酸疫苗奠定基础.方法 RT-PCR扩增JEV的prM-E-NS1和小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)后,分别克隆人中间载体pIRES,经酶切获得prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段,并将其插入pCAGGSP7质粒,鉴定阳性重组子.结果成功的将prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段插入到pCAGGSP7质粒,测序鉴定结果正确,该质粒命名为pCAG-JG.结论成功的构建了pCAG-JG双顺反子真核表达质粒.
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流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因的克隆及高效表达研究进展
流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)是乙型脑炎病毒Iencephalitis B Vims),又称日本脑炎病毒(Japanese EncephalitisVirus,JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病.
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光化学法对血液中病毒的灭活效果研究
目的:筛选并验证全血中脂质包膜病毒灭活的佳光化学方法.方法:以f2噬菌体为试验病毒,通过噬斑计数法筛选佳灭活血液中病毒的光化学法,并通过正交试验筛选灭活血液中病毒的佳作用条件;以HIV-1和日本脑炎病毒为试验病毒,通过细胞感染试验验证佳光化学法对血液中脂质包膜病毒的灭活作用.结果:与核黄素和金丝桃素相比,亚甲基蓝(MB)所致的光化学效应对血液中f2噬菌体的灭活作用显著(P＜0.05);在使血液中f2噬菌体下降超过5个对数级时,MB光化学的佳作用条件分别是:MB终浓度为15 μmol/L,可见光(640 nm)照射强度为40 000 Lux,光照射作用时间40 min;在相同MB加入剂量和光照射强度下,照射10 min,血液中HIV全部灭活(下降5.78个对数级),照射20 min,血液中日本脑炎病毒全部灭活(下降7.00个对数级).结论:亚甲基蓝光化学法可高效灭活全血中f2噬菌体、HIV-1与日本脑炎病毒.
