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猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性
为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT-PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM.通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK-15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子.再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构.进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cDNA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征.由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础.
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猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定
用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C-株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK-6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT-PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定.结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性.猪瘟病毒C-株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具.
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地高辛标记的ZNF216 cRNA探针的制备及鉴定
制备地高辛标记的ZNF216 cRNA探针.将目的基因ZNF216重组到pBluescriptⅡSK(-)载体转录模板,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序.随后单酶切使模板线性化,利用T7和T3酶体外转录合成一对ZNF216cRNA探针,琼脂糖凝胶电泳及原位杂交技术检测ZNF216 cRNA探针.结果表明,ZNF216 cRNA探针制备成功,其敏感性和可信性高,为深入研究锌指蛋白ZNF216的功能提供了有用的工具.
关键词： 体外转录 地高辛标记 锌指蛋白ZNF216 原位杂交 -
PDGF受体β亚单位2个不同切割位点核酶的体外切割效率的比较
目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较.方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA 45位CUU和252位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2,定点克隆于自我切割型核酶载体P1.5的5′-cis核酶和3′-cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA 608 bp的PCR片段克隆于pGEM-T载体T7启动子下游,在T7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA,比较RZ1和RZ2对706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异.结果 RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性.结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的.
关键词： 核酶 PDGF受体β亚单位 体外转录 体外切割 -
乙肝病毒特异性核酶的构建及体外切割活性的初步研究
设计针对HBV复制中间体mRNA的核酶,用于抗病毒治疗是国内外的一个研究方向.利用重组PCR技术合成了核酸基因(简称RZ),并克隆于T7启动子下游,进行了体外转录及切割活性的研究.
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抗HPV16E6核酶的原核表达与体外活性研究
目的 获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤.方法 以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中.将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性.结果 抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来.HPV16E6 mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段(+94位～+296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物.结论 所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6 mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具.
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体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒感染Huh7.5细胞的透射电镜观察
目的 通过透射电子显微镜技术观察体外培养的嵌合体丙型肝炎病毒(HCV)感染Huh7.5细胞后胞内病毒颗粒的形态学特征及细胞内部超微结构的变化.方法 将含有全长HCV嵌合基因组的质粒pFL-J6/JFH体外转录为HCV RNA,电穿孔转染至Huh7.5细胞,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定培养上清中病毒数量;间接免疫荧光检测病毒蛋白的表达;收取转染后细胞培养上清感染原始Huh7.5细胞,制作超薄细胞切片,透射电子显微镜技术观察被感染细胞中病毒颗粒的形态学特征及细胞超微结构的变化.结果 qRT-PCR显示不同时间点收取的转染后细胞培养上清中含有高水平的病毒量;间接免疫荧光显示病毒NSSA非结构蛋白高表达;透射电子显微镜观察到被感染的Huh7.5细胞内含有大量有包膜或无包膜的病毒样颗粒,细胞质内部分膜性细胞器增生,出现黄病毒科病毒感染后特征性结构及某种未知结构等.结论 体外培养的嵌合体HCV具有HCV颗粒的形态学特征,并能够有效感染人源性肝细胞Huh7.5.
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H5N1禽流感病毒抗原基因的体外转录及RNA标准品构建
目的 通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M(M)基因的RNA片段,为病原学检测提供阳性定量标准品.方法 设计H5N1禽流感病毒的HA、NA及M基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA,用RT-PCR获得相应片段,分别连接至Pgem-T easy质粒,转化宿主菌XL10-Gold,然后提取阳性克隆的重组质粒DNA,测序鉴定后用限制性核酸内切酶Nde I酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物用Dnase酶处理、纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证.结果 获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M基因全长开放阅读框序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为503.9、379.2、437.8ng/μl.结论 获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品.
关键词： H5N1亚禽流感病毒 克隆 体外转录 -
RNA干扰现象阻止丙型肝炎病毒基因表达和复制
1995年,康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义和正义RNA都能阻断基因的表达.1998年,Andrew的研究证明:在正义RNA阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA.这些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi,也译作RNA干预或者干涉).它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的.随后的研究中发现,RNAi现象广泛存在于植物、原生动物、昆虫、线虫和哺乳动物中[1].RNAi的主要作用是可以特异性地使特定的基因沉默,从而起到控制细胞的各种高级生命活动.这为各种疾病如病毒病和肿瘤等的防治打开了一条全新的途径.由于RNAi的重要意义和近年来不断取得研究进展,<科学>杂志在2001年将其列为十大科学成就之一,2002年又将其列为当年十大科学成就之首.同时<自然>杂志也将小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNA),评为2002年重大科技成果之一.
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HCV干扰素敏感决定区"基因盒"的构建,体外表达及功能探讨
目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因"盒",包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58 000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的.
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MAT1基因沉默对胰腺癌细胞生长的影响
我们既往的研究证实,作为调控细胞周期循环的关键基因之一,人类MAT1( ménage à trios 1)基因在胰腺癌组织中表达增强,它参与胰腺癌的发生[1-2]引.转染反义MAT1基因可使胰腺癌细胞出现明显的G1期阻滞[3].为此,本研究应用体外转录法合成靶向MAT1基因的小干扰RNA( small interference RNA,siRNA),转染胰腺癌Capan-2细胞,观察其对细胞的生长抑制效应,探讨siRNA沉默MAT1基因用于胰腺癌基因治疗的可行性.
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应用CRISPR-CAS9技术制备miR-155基因敲除小鼠
目的：探讨利用typeⅡbacterial CRISPR/CAS9系统构建miR RNA-155基因敲除小鼠的可行性。
方法：首先，利用软件设计构建识别靶定靶序列的sgRNA，构建致靶基因切割的CRISPR/Cas9载体质粒；然后体外鉴定sgRNA/Cas9的活性检测；设计构建基因敲进的打靶载体；体外转录sgRNA/Cas9 mRNA；小鼠受精卵注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；后miR-155基因敲除F0代C57/BL6小鼠的可遗传性检测，并剪鼠尾提DNA进行鉴定。 -
chOPG RNA探针的制备及其在鸡骨组织的原位杂交
目的 制备地高辛标记的禽OPG cRNA探针.方法 将目的片段重组到T载体中,构建chOPG/pGM-Teasy重组质粒,EcORI酶切鉴定并测序验证.分别用SalI和NcoI进行酶切得到线性化DNA模板,用Sp6和T7 RNA聚合酶体外转录合成地高辛标记的正反义RNA探针.运用斑点杂交的方法检验探针的标记效率,并通过骨组织原位杂交反应进一步检测探针标记是否制备成功.结果 成功构建出chOPG/pGM-Teasy质粒.结论 获得的高效正、反义chOPGRNA探针,为进一步研究OPG在蛋鸡各组织中的表达奠定基础.
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体外转录法制备人野生型MDR1基因mRNA
目的应用体外转录法大量制备人野生型多药耐药基因MDR1的mRNA,转染人造血干细胞后检测P糖蛋白表达.方法含人野生型MDR1基因的cDNA经酶切连接后构建可体外转录的模板,经体外转录得到mRNA,转染人造血干细胞,通过RT-PCR法检测mRNA及Western-bloting法检测P糖蛋白表达.结果转染后细胞mRNA相对含量(1.380)明显高于对照组(1.105)(P＜0.01);Western-bloting可见转染组MDR1基因编码的P-gp蛋白条带明显强于对照组.结论经体外转录法可大量制备人野生型MDR1基因的mRNA,并可成功应用于转染人造血干细胞,产生P糖蛋白表达.
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HIV基因组感染性克隆的构建原理及应用
感染性克隆技术也称拯救病毒,是将病毒的基因组RNA逆转录成cDNA,对得到的cDNA进行修饰和改造,进行克隆后,利用体外转录技术或其他的方法,将cDNA拷贝转回到RNA状态,成为改造后的病毒基因组.而感染性克隆就是指在细菌质粒中含有病毒全基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性.
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体外转录法大量制备登革2型病毒RNA
登革病毒在复制过程中不形成DNA中间体,要在基因水平研究其特征存在一定的困难,因为突变、重组、克隆等分子生物学技术都是在DNA水平上的操作.体外转录制备感染性RNA(感染性转录体)技术提供了解决这一难题的新途径[1],它大致包括全长cDNA克隆的构建、体外转录和转染3个步骤.由于RNA易于降解,在转染敏感细胞时就需要大量的感染性转录体.本研究采用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems,对带有登革2型病毒全长cDNA的质粒QH-04/MON501,TB62,TB203进行了体外转录.在对转录反应中各加入成分的比例进行调试后,能在体外大量制备登革2型病毒RNA.
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TaqMan(R)实时定量RT-PCR检测G3型轮状病毒VP7基因方法的建立
目的:建立一种检测G3型轮状病毒VP7基因的TaqMan(R)实时定量RT-PCR方法.方法:设计轮状病毒VP7基因型特异性引物和探针,采用体外转录RNA为标准品,建立TaqMan(R)实时定量RT-PCR方法.结果与结论:本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对107～101 copies·μL-1轮状病毒VP7基因进行有效检测,为G3型轮状病毒的检测和定量提供了有用的工具.
关键词： 轮状病毒 实时定量PCR TaqMan(R)探针 体外转录 RNA标准品 -
基因体外转录的应用研究
大量研究表明,基因表达的调控发生在基因复制、转录、转录后、翻译和翻译后等环节上.而基因转录的调控是逐级调控中关键的环节.由于参与调控的因素有很多,调控的过程非常复杂,因此在体内自然条件下,对基因的转录情况进行研究比较困难.
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hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录
目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.
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靶向CDC42基因小干扰RNA分子的制备
目的 制备靶向CDC42基因的小干扰RNA分子(siRNA)并检测其对CDC42基因表达的抑制效果.方法 针对CDC42基因的不同区域设计4条siRNA分子,体外转录法合成siRNA分子,将siRNA与CDC42基因真核表达载体共转染HEK 293T细胞,Western blot法测定CDC42蛋白含量.结果 合成了siR1、siR2、siR3、siR4共4条siRNA分子,siR3对CDC42基因表达的抑制率为95%,siR1、siR2以及siR4对CDC42基因表达的抑制作用不明显.siR3对HEK 293T细胞生长无明显影响.结论 体外转录法制备的siR3分子能够高效特异地抑制CDC42基因表达.
