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红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析
目的:克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础.方法:根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABA THMT基因cDNA序列及基因组序列.通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABA THMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较.结果:克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸.该基因蛋白序列具有保守的SA-BATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶.基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达.忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异.结论:SABA THMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础.
关键词： 金银花 SABATH甲基转移酶 全长cDNA 内含子 -
口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定
设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡.以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒.
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狂犬病毒街毒株全长基因cDNA克隆的构建及鉴定
利用分子克隆的方法,将狂犬病毒街毒株的全基因组分为4个片段按照它们基因组上的顺序克隆到真核表达载体pVAX1上,并将GL间隔区的非编码区替换为表达绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸,构建出表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组狂犬病毒HN10株全长基因组cDNA真核表达质粒,同时,在全长cDNA的两侧嵌入锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)的序列,并置于CMV启动子的控制下,为下一步拯救出该嵌合病毒提供了可直接使用的全长cDNA真核表达质粒.
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麻疹病毒全长cDNA构建及其感染性的研究
为发展新型疫苗和改造目前使用的麻疹病毒疫苗,以麻疹病毒疫苗株为模板,构建了具有感染性的麻疹病毒cDNA克隆.用RT-PCR分6段扩增出麻疹病毒全长基因,通过酶切、拼接构建麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列,并精确地置于T7启动子控制下与丁型肝炎病毒核酶序列之前.克隆麻疹病毒CC-47株蛋白N、P、L编码区质粒并置于T7启动子控制下,用4个质粒共转染哺乳动物细胞,在表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3的作用下进行病毒拯救.经免疫荧光、PCR等方法检测证实,获得了具有感染性的麻疹病毒.所拯救的病毒在哺乳动物细胞连续传3代后,仍能检出病毒抗原和核酸.
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猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定
用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C-株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK-6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT-PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定.结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性.猪瘟病毒C-株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具.
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犬贾第虫病毒感染性体外转录体制备及转染试验
目的 研究犬贾第虫病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性,为进一步研究犬贾第虫病毒的特性、深入阐明病毒的致病机理奠定基础.方法 根据已知的GCV(长春株)基因序列设计一套特异性重叠引物,利用RT-PCR 技术,构建感染性犬贾第虫病毒基因组全长cDNA ;用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System制备体外转录体,电穿孔方法感染无病毒株犬贾第虫滋养体,通过提取总核酸和超薄切片电镜观察感染情况.结果 成功构建犬贾第虫病毒基因组全长cDNA,体外转录体电穿孔后72 h,提取的总核酸中发现6.2 kb的dsRNA带,电镜观察到完整的病毒粒子.结论 该转录体具有感染性,可以在无病毒株犬贾第虫滋养体内复制表达,为进一步研究GCV奠定基础.
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反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用
反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域.本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabies virus,RV)研究中的应用.
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应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA
目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA,为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达,深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础. 方法根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列,设计上下游引物.从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增.为检验扩增产物的特异性,以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段.将含有复杂二级结构的5′非编码区的扩增片段,在377A型自动测序仪进行序列分析. 结果扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子,非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有. 结论利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子.
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我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究
目的研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性,为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础. 方法以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板,用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体,经电穿孔转染细胞,观察其致细胞病变效应.从病变细胞培养上清中提取总RNA,用病毒特异引物进行RT-PCR扩增,以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致. 结果我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变,从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段. 结论构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性,可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒.
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我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA的构建
目的构建我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA，为进一步研究其体外RNA转录产物的感染性，阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型病毒参考株NGC株的核苷酸序列，利用DNASTAR软件设计覆盖登革2型病毒43株基因组的6对重叠引物。从感染登革2型病毒43株的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA，采用RT-PCR分别扩增6条基因片段，并将其分别与pGEM-T载体进行连接。重组质粒用PCR进行快速鉴定，并在377A型自动测序仪进行序列分析。然后利用单一酶切位点，分别自阳性重组子上切下各基因片段，在体外分别进行5′半分子和3′半分子的连接，后将5′和3′半分子连接成基因组全长的cDNA。扩增各接头两侧长约457～691bp的基因片段，连接至T载体后测序，从而对全长cDNA进行鉴定。结果共扩增出6条约1.5～2.5kb的基因片段，并在体外进行连接，获得了全长cDNA。结论通过测序证实成功地构建了我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明我国登革病毒株的毒力及致病机理奠定基础。
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表达序列标签拼接及验证研究进展
后基因组时代已经来临,基因组序列注释是其主要目标之一.本文就查找EST同源序列方法、各类拼接软件优缺点、现有转录组数据库和预测的蛋白质组数据库、全长cDNA判断方法及ORF选择等方面进行综述,并讨论基因预测方面的困难和不足及任务的长期性.
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扩增我国登革2型病毒全长cDNA分子的融合PCR方法
目的:建立扩增登革2型病毒基因组全长cDNA的融合PCR法,为深入探讨病毒基因组的结构与功能提供有效的技术途径.方法:根据我国登革2型病毒D2-43株序列设计引物,首先采用长链RT-PCR技术扩增病毒基因组5′及3′半分子,然后以半分子采用融合PCR法将两个半分子构建成全长cDNA分子.为进一步证实所构建全长cDNA分子的特异性,再以融合PCR产物为模板扩增5′非编码区序列,与pGEM-T载体连接,在377A型自动测序仪进行序列分析.结果:通过对逆转录反应及PCR扩增条件的优化,建立了制备大片段cDNA及构建全长cDNA分子的融合PCR方法.扩增的我国登革2型病毒的5′及3′半分子的长度均为5 kb左右,采用融合PCR方法制备的全长cDNA长约11 kb,与预期大小一致,非编码区测序结果表明扩增产物为D2-43所特有.结论:所建立的融合PCR方法是构建登革病毒基因组全长cDNA的有效技术.
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cDNA末端快速扩增技术及其在血液疾病上的应用
克隆新基因及获得其cDNA全长是现代生命科学中研究基因功能的重要前提.以PCR为基础的cDNA末端快速扩增(RACE)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA全长的方法.该文主要概述RACE技术的原理、进展及其在血液疾病基因克隆方面的应用.
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草珊瑚叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析
目的 构建草珊瑚Sarcandra glabra叶片全长cDNA文库,进一步发掘与草珊瑚代谢及抗逆相关的基因,为草珊瑚功能基因的发现提供实验基础.方法 以草珊瑚的嫩叶为实验材料,利用SMART法(即Clontech公司SMARTer试剂盒)构建草珊瑚全长cDNA文库.利用ABI3730 DNA序列分析测序获得大量的EST序列,利用生物信息分析方法对EST序列进行功能注释.结果 构建了草珊瑚叶片的全长cDNA文库,经过鉴定草珊瑚cDNA文库的文库滴度为1.14×107 cfu/mL,平均插入片段为1 000bp.利用该文库测序了221个单克隆,共获得EST序列177条,拼接出151个单一序列;利用NCBI数据库进行同源比对分析,共有119条(79％)与已知基因有显著的同源性,进行GO功能注释,显示其表达术语涉及了细胞生长,信号转导,蛋白质合成、转录,抗逆反应以及能量代谢等.结论 构建了符合要求的草珊瑚叶片全长cDNA文库,并对相关EST序列进行了生物信息学分析,为草珊瑚基因组学研究提供一定的参考.
关键词： 草珊瑚 全长cDNA 表达序列标签(EST) 基因注释 GO功能注释 -
登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增
目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组.方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6 RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaI内切酶位点.从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增.以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段.结果长链RT-PCR法扩增出约11kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列.结论通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组,为进一步构建感染性克隆打下基础.
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乙型脑炎减毒株SA14-14-2全长cDNA克隆感染性的研究
目的 在获得乙型脑炎病毒(JEV)全长cDNA分子的基础上,建立感染性转录体,获得恢复病毒,为JEV致病机理、疫苗研制及分子病毒学研究提供方法.方法 将全长JEV cDNA分子克隆入改造后的pBluescript KS Ⅱ(+)载体上,经T7启动子体外转录,在Lipofectamine 2000介导下,将转录产物转染入BHK-21细胞,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验鉴定恢复病毒.结果 转录产物转染BHK-21细胞后,观察到明显的细胞病变;收获恢复病毒,经RT-PCR、测序、间接免疫荧光试验及噬斑试验证实为JEV.结论 已建立了JEV全长cDNA克隆经体外转录获得JEV感染性RNA的方法,为JEV分子生物学及疫苗研究等奠定了基础.
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传染性法氏囊病病毒疫苗株B87基因组A节段的克隆和序列分析
目的 获得传染性法氏囊病病毒疫苗株B87 A节段全长cDNA,并对其进行序列分析.方法 使用蛋白酶K、酚/氯仿抽提法提取病毒基因组,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得A节段的全长cDNA.将其克隆至pGEM-T载体上,测序,并用DNAStar软件进行序列分析.结果 测序结果表明,克隆的B87株A节段全长为3 260 bp,与Gt株的同源性高为99.5%,与其他毒株的核苷酸同源性介于95.2%～99.4%之间,与Ⅱ型毒株OH仅为84.0%.结论 通过对20株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测A片段上7个独特的氨基酸位点可能与毒力相关.
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以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA
目的 以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组.方法 根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEV SA14-14-2株的5'和3'半长分子,在5'端上游引物中引入T7启动子核心序列.利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5'和3'两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEM T-easy载体,酶切鉴定并测序.结果 扩增出均6 000 bp的JEV的5'和3'两个半长分子及约11 000 bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失.JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性高达99%,其氨基酸序列同源性高达96.3%.其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异.结论 已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础.
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获取充足肺腺癌及同源正常组织全长cDNA有效方法的探讨
目的获取肺腺癌及同源正常组织完整的RNA分子,并由此逆转录成全长cDNA,经各种杂交手段,筛选未知基因片段.方法从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA,经琼脂糖凝胶电泳确认RNA未降解后,在oligodT-primer的引导下,将mRNA逆转录成ds cDNA,并在ds c DNA 上游及下游连接上不同的适配子(adaptor),连接适配子的ds cDNA分别在不同的引物引导下 ,经PCR扩增并富集出大量的全长cDNA.结果扩增出肺腺癌及同源正常组织的全长cDNA,肺正常组织的cD NA基因片段在0.3～1.9kb之间,而肺腺癌的片段在0.3～4.5kb之间.结论长距离cDNA PCR是从微量ds cDNA起始材料中获得大量的全长cDNA信息的有效方法.
关键词： 全长cDNA 长距离cDNA PCR 肺腺癌 -
人Slit2全长cDNA的真核表达及鉴定
目的:对人神经轴突导向因子Slit2(hSlit2)全长eDNA进行真核表达并进行鉴定.方法:采用分段克隆的方法获得hSlit2全长cDNA的克隆,并构建hSlit2全长cDNA真核表达重组质粒pCMV-GFP-C/hSlit2,用磷酸钙共沉淀法将其转染到人胚肾细胞HEK-293细胞中,通过免疫印迹法鉴定其蛋白表达.结果:经酶切鉴定证实hSlit2全长cDNA的真核表达载体构建成功,免疫荧光蛋白和Western blot结果证实hSlit2全长cDNA在HEK-293细胞中的表达.结论:人神经轴突导向因子hSlit2真核表达载体构建成功,为进一步完善hSlit2蛋白及各水解片段功能研究提供了实验基础.
