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获取基因全长cDNA策略及应用
全长cDNA是研究基因功能的关键,获得全长cDNA也是基因组研究的重要内容之一,本文概述了近年来国内外获取未知基因cDNA全长的理论及其应用.
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牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序
目的 构建牛带绦虫(Taenia saginata)成虫全长cDNA质粒文库,为寻找更多有效的牛带绦虫病疫苗候选抗原分子及对三种主要人体带绦虫的功能基因对比研究奠定基础.方法 提取牛带绦虫成虫mRNA;进行反转录合成双链cDNA.PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行Sfi I酶切;用CHROMA SPIN-400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并与改造载体pBluescript II SK连接,将连接产物涂板,测定文库的滴度;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建文库质量.随机挑选质粒文库转化的阳性重组克隆,进行较大规模的5'端测序,归并UniGene.结果 测定文库的滴度为1 016个菌落/μL,共测1 023个克隆,对这些序列进行UniGene归并,得到419条unigene.结论 已成功获得高质量的牛带绦虫成虫全长cDNA表达文库.
关键词： 牛带绦虫 全长cDNA 质粒文库 表达序列标签(EST) -
细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定
目的分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA（3'和5'端,尤其是基因的5'非翻译区）。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库,筛选全长目的基因,研究其结构和功能。方法采用TRIZOL试剂提取E.granulosus总RNA,用ClonTech公司的SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建E.granulosus原头节全长cDNA文库,文库的包装使用EICENTER TECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库，文库滴度为1.4×107 pfu/ml。文库的重组效率达到99%以上,插入片段长度约为1.1kb。
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肝细胞癌高表达基因片段P02的全长RACE扩增和序列分析
目的扩增肝细胞癌高表达基因基因P02的全长cDNA序列,并利用生物信息学知识对其进行分析,为进一步研究该基因在肝细胞癌发生、发展中的作用奠定基础.方法运用SMART RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术扩增P02的5'和3'末端cDNA,对RACE PCR产物作TA克隆,碱裂解法抽提阳性克隆质粒,酶切和PCR验证目的片断的插入,Sanger双脱氧链中止法测序,利用BLAST、基因探索者等生物学软件对序列进行分析、拼接,获得全长cDNA,利用在线预测软件预测该基因的生物学功能.结果获得865bp的全长cDNA序列,其开放读码框长172个氨基酸,与TPT1基因高度同源,是一个生理功能尚未完全明了、与生长相关的蛋白质,蛋白质结构和功能预测提示:该基因产物可能是一个位于细胞膜的与生长相关的裂解酶.结论在肝细胞癌组织中成功克隆扩增了长865bp的P02全长cDNA序列,为进一步功能研究奠定基础.
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鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析
Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白.本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3'和5'快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号:AY392097).序列分析表明:鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7.15kDa.鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域.鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础.
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一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因
分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV) 上海株SH95的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2-4-3基因,将其克隆入pGEM-T载体,并进行序列分析,其与超强毒株HK46的核苷酸序列的同源性达98%,整个基因有5个氨基酸差异,同源性达99.51%(1007/1012).
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乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究
本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.
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丙型肝炎病毒JFH1适应性突变株全长cDNA的构建
目的 构建丙型肝炎病毒JFH1全长cDNA克隆,获取突变位点信息. 方法 应用长片段RT长片段RT-PCR技术对不同时期传代的JFH1病毒株进行分段扩增. 通过共同酶切位点连接成9. 7Kb从DNA片段,与pBlueScript2ks( +)形成克隆载体,进一步测序分析. 结果 获取丙型肝炎病毒JFH1系列适应性突变株全长cDNA模板,共发现23个单核苷酸突变. 结论 丙型肝炎病毒JFH1 系列存在单核苷酸突变位点,为进一步了解HCV JFH1适应性突变位点功能奠定基础.
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RACE:一种研究新基因的有效方法
RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术是以PCR和RNA反转录为基础,通过部分已知基因序列(如EST)快速扩增cDNA的3'端或5'端未知序列区域,获得全长cDNA,研究新基因的一种有效方法.本文针对该项技术自身存在的优缺点,同时结合国内外的新研究改进方案,对该技术作一概述.
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由构建的基因组全长cDNA所回收的我国登革2型病毒株的鉴定
目的由构建的病毒基因组全长cDNA回收具有感染性的我国登革2型病毒株,为进一步阐明登革2型病毒的致病机制及其新型疫苗的研制奠定基础.方法用SP6 RNA聚合酶系统制备我国登革2型病毒(D2-43)株基因组全长cDNA的体外RNA转录物,纯化后经电穿孔法转染C6/36细胞,观察致细胞病变作用以判断其感染性.从病变的细胞和培养上清中提取总RNA,通过RT-PCR扩增及克隆测序的方法证实细胞病变确为RNA转录物感染所致.同时收集可产生细胞病变的培养上清,再感染C6/36细胞以进一步证实所回收的登革2型病毒感染的稳定性.结果以我国D2-43病毒株基因组全长cDNA为模板制备的体外RNA转录物可使C6/36细胞产生病变,从病变细胞和培养上清中可扩增获得病毒特异的基因片段.在培养细胞中进行连续传代仍可产生细胞病变作用.结论构建的我国D2-43株基因组全长cDNA的体外RNA转录物对传代蚊细胞具有感染性,表明可产生完整的病毒颗粒.本研究可为阐明登革2型病毒的致病机理及探索新的预防和治疗措施奠定基础.
